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| CB2受体激动剂及AMPK激动剂干预疤痕疙瘩形成的研究 摘要 瘢痕疙瘩(Keloid)是指皮肤损伤后，创面部位在自愈过程中局部组织过度纤维化，胶原纤维过度增生瘢痕化的病理损伤。瘢痕疙瘩的生长范围超过原有损伤范围并侵犯周围皮肤，呈瘤样增生，属于代谢生长比较活跃、极少进入成熟阶段的疤痕组织。在瘢痕疙瘩形成过程中，活化的成纤维细胞爬行至创面周边并部分转化为肌成纤维细胞。我们认为一些成纤维细胞为对抗严重应激所采取的生存逃逸策略是皮肤受到显著创伤后形成瘢痕疙瘩的原因。在受到严重创伤后，成纤维细胞出现DNA损伤反应(DNA Damage Response)，继而P53基因发生突变并积聚，进而细胞生长周期延长来修复DNA双链损伤，H2AX迅速磷酸化，细胞无法自行修复。本实验从瘢痕疙瘩形成后低氧应激微环境切入，以肌成纤维细胞干性化和表皮细胞间质化为理论依据，采用表皮HaCaT细胞和人成纤维细胞HSF进行体外细胞建模，从细胞形态学角度、免疫印迹试验(Western Blot)和酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法对建立的体外模型进行验证，之后进一步通过对人瘢痕疙瘩的体外培养取得人瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞，用免疫印迹试验和酶联免疫吸附试验进一步验证AMPK激动剂和CB2受体激动剂在干预及逆转成纤维细胞肌成纤维化的作用。本实验试图探索从抗炎、代谢两个角度干预瘢痕疙瘩形成，为找到更有效、安全的治疗手段提供基础理论，并为后续临床应用提供理论基础。实验结果显示，上皮细胞和成纤维细胞在转化生长因子-β1(TGF-β1)的刺激下，分别发生了上皮细胞间充质化(EMT)和成纤维细胞肌成纤维化，随着TGF-β1浓度的增加，其细胞外基质的含量也大大增加。加入AMPK激动剂或CB2受体激动剂后，由于缺氧诱导因子HIF1-α和VEGF的生成被抑制，缓解了DDR造成的HaCaT的EMT转化和HSF的肌成纤维化，也减少了胶原蛋白的合成，从而产生抗瘢痕的作用，进一步采用人瘢痕疙瘩来源成纤维细胞进行验证也得到了相似的结果。 关键词：瘢痕疙瘩，成纤维细胞，肌成纤维化，AMPK激动剂，CB2受体激动剂 目 录 第一章 绪论----------------------------------------------------------------------------------1 1.1 瘢痕疙瘩研究与治疗现状-------------------------------------------------------------1 1.2 缺氧诱导因子----------------------------------------------------------------------------1 1.3 成纤维细胞-------------------------------------------------------------------------------1 1.3.1瘢痕疙瘩成纤维细胞的来源---------------------------------------------------1 1.3.2肌成纤维细胞转分化-----------------------------------------------------------2 1.4 上皮细胞-间充质转化EMT------------------------------------------------------------2 1.4.1上皮细胞-间充质转化----------------------------------------------------------2 1.4.2转化生长因子TGF-β1----------------------------------------------------------2 1.5 DNA损伤反应与H2AX-------------------------------------------------------------2 1.6 腺苷酸活化蛋白激酶-------------------------------------------------------------------3 1.7 大麻素受体激动剂----------------------------------------------------------------------3 1.8 本章小结----------------------------------------------------------------------------------3 第二章 实验材料与方法-----------------------------------------------------------------------4 2.1 细胞培养-----------------------------------------------------------------------------4 2.2细胞形态学观察------------------------------------------------------------------------4 2.3提取细胞总蛋白-----------------------------------------------------------------------5 2.4 测定蛋白浓度--------------------------------------------------------------------------6 2.5 Western Blot免疫印迹-----------------------------------------------------------------6 2.6 ELISA酶联免疫吸附测定----------------------------------------------------------10 2.7主要仪器-------------------------------------------------------------------------------12 第三章 实验结果------------------------------------------------------------------------------13 3.1 细胞形态学观察----------------------------------------------------------------------13 3.1.1 无氧环境构造------------------------------------------------------------------13 3.1.2 TGF-β1诱导上皮间质转化--------------------------------------------------13 3.1.3原代瘢痕疙瘩组织成纤维细胞----------------------------------------------15 3.1.4 AMPK激动剂和CB2受体激动剂干预细胞EMT-------------------------15 3.2 Western Blot免疫印迹---------------------------------------------------------------16 3.2.1 TGF-β1诱导人成纤维细胞EMT----------------------------------------------16 3.2.2 TGF-β1诱导人表皮细胞EMT-------------------------------------------------18 3.2.3 CB2受体激动剂干预人成纤维细胞EMT----------------------------------19 3.2.4 AMPK激动剂干预人成纤维细胞EMT-------------------------------------21 3.3 ELISA酶联免疫吸附测定---------------------------------------------------------24 第四章 讨论-------------------------------------------------------------------------------------25 第五章 结论-------------------------------------------------------------------------------------31 参考文献-----------------------------------------------------------------------------------------32 致谢---------------------------------------------------------------------------------------------34 |
