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| Wnt受体LRP56在骨关节炎中的作用研究 摘 要 研究目的： 本研究旨在通过构建骨关节炎模型从体外及体内两方面观察探究低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（LRP5/6）在骨关节炎发生发展中的作用，同时初步探讨LRP5/6影响骨关节炎发展的相关机制。 研究方法： 首先通过对半月板失稳术（DMM）在小鼠上构建膝骨关节炎的模型，检测LRP5/6在骨关节炎模型中的表达情况，明确LRP5/6的存在对骨关节炎发生发展的作用。而后在转基因小鼠上构建骨关节炎模型，探究LRP5/6及β-catenin的基因敲除鼠对于小鼠骨关节炎模型的影响，初步确定LRP5/6及β-catenin在骨关节炎过程中的具体作用。进而，为在体外进一步确证LRP5/6的作用，通过利用TNF-α刺激人原代滑膜细胞诱导骨关节炎细胞模型，从DKK-1促使LRP5/6下膜以及MDC促使LRP5/6回膜两方面进行探索，观察LRP5/6的上下膜对于滑膜细胞MMP13及Col2a表达的影响，从而在细胞水平验证LRP5/6在体外实验中对骨关节炎中的作用。最后，通过收集临床患者标本，初步检测临床骨关节炎患者滑膜细胞中LRP5/6的蛋白表达情况，为LRP5/6在临床应用中的进一步探索提供初步实验基础。 研究结果： 小鼠构建膝骨关节炎模型后4周，出现了小鼠关节软骨面的缺损，MMP13蛋白表达的升高及COl2a蛋白表达的降低，同时小鼠DMM模型组相比于对照组，其滑膜及关节软骨LRP5/6的表达显著增高。通过对转基因小鼠进行LRP5/6（β-catenin）基因敲除后构建小鼠骨关节炎模型，该实验结果显示，LRP5/6的缺失会加重小鼠膝关节炎的严重程度，表现为更为严重的关节软骨缺损，关节软骨细胞紊乱等，同时相比于野生型小鼠，LRP5/6敲除鼠滑膜及关节软骨中MMP13的表达明显升高，Col2a的表达明显降低；而β-catenin的缺失则会减轻小鼠膝关节炎的严重程度，呈现与LRP5/6的缺失相反的表现。 体外实验利用TNF-α刺激人原代滑膜细胞诱导骨关节炎细胞模型，从DKK-1促使LRP5/6下膜以及MDC促使LRP5/6回膜两方面的结果表明，LRP5/6的下膜会使滑膜细胞MMP13的表达进一步增加，Col2a的表达进一步降低，而MDC的刺激会减弱DKK-1作用下的MMP13表达增加及Col2a表达降低的程度。同时，在临床滑膜组织标本检测实验中发现，骨关节炎患者滑膜相比于对照组LRP5/6蛋白表达明显升高。 研究结论： 本课题首次研究了LRP5/6在骨关节炎发生发展中的作用及初步机制。结果表明，LRP5/6对骨关节炎的发生发展起着一定的保护作用，LRP5/6的缺失会加重骨关节炎的程度，同时细胞膜上LRP5/6的表达改变存在通过非Wnt/β-catenin信号通路的途径影响MMP13及Col2a的表达，通过对关节软骨合成代谢平衡的调节，从而在骨关节炎的发展中起到一定的保护作用。 关键词：LRP5/6，骨关节炎，关节软骨，滑膜 目 录 摘 要 4 Abstract 6 缩略词表 8 前 言 9 实验材料 11 一、 标本来源及资料记录 11 二、 实验动物 11 三、 主要试剂 11 四、 细胞刺激药物 12 五、 主要仪器和设备 12 六、 主要试剂配制 13 (一) 总蛋白裂解液（1ml） 13 (二) Western-blot分离胶（8%） 13 (三) Western-blot分离胶（10%） 13 (四) Western-blot分离胶（12%） 13 (五) Western-blot浓缩胶（5%） 14 (六) Western-blot电泳缓冲液 14 (七) Western-blot电转缓冲液 14 (八) Western-blot TBS液 15 (九) Western-blot TBST液 15 (十) Western-blot 封闭液 15 (十一) 5×蛋白上样缓冲液 15 (十二) 一抗稀释液 15 七、 主要实验耗材 15 实验方法 17 一、 人原代滑膜细胞提取及培养 17 二、 细胞传代及培养 17 三、 细胞计数及铺盘 17 四、 细胞干预刺激 18 五、 细胞蛋白样本的提取 18 六、 蛋白浓度测定与调平、待上样样品配制 19 七、 细胞RNA提取 19 八、 RNA浓度测定与调平 20 九、 小鼠膝骨关节炎模型的建立 20 十、 小鼠膝骨关节蛋白样品的制备 21 十一、 小鼠膝骨关节RNA样品的制备 22 十二、 转基因小鼠基因型鉴定及基因敲除 22 十三、 Western-blot（蛋白印迹实验） 22 十四、 RNA逆转录 24 十五、 qPCR 24 十六、 统计学分析 25 实验结果 26 一、 体内实验 26 (一) 小鼠膝骨关节炎模型建立与评估 26 (二) 小鼠膝骨关节炎模型组相比于对照组LRP5/6蛋白表达明显升高 26 (三) 全身敲除LRP5/6转基因小鼠相比于对照组骨关节炎程度加重 26 (四) 全身敲除β-catenin转基因小鼠相比于对照组骨关节炎程度减轻 27 二、 体外实验 28 (一) TNF-α能引起滑膜细胞LRP5/6、MMP13、Col2a表达改变。 28 (二) DKK-1影响TNF-α刺激下滑膜细胞MMP13、Col2a的表达。 28 (三) 滑膜细胞膜上LRP5/6蛋白影响TNF-α刺激下滑膜细胞MMP13、Col2a的表达。 28 (四) 骨关节炎患者滑膜组织LRP5/6蛋白表达相比正常滑膜明显升高。 29 讨论 30 结论 33 意义 33 不足与展望 33 综述- Dickkopf-1在骨关节炎中的研究进展 34 |
