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| 外周血循环肿瘤DNA在结直肠癌中应用价值的探索研究 中文摘要 研究目的： 结直肠癌（colorectal cancer，CRC）早期、精准诊疗是临床面临的新挑战。传统上，肿瘤诊断是以组织标本提供的病理学为金标准，但在获取组织活检时存在有创操作的风险、无法获取肿瘤组织的困难。而以循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）为代表的液体活检给临床诊治带来了新的希望。ctDNA的检测具有易获取、可重复采集、相对无创、敏感度及特异度较高的优点。目前主要的检测途径分为两大类，一类为基于PCR的途径，另一类是基于基因测序的途径。本研究我们通过使用基于PCR和基因测序的ctDNA检测技术，寻找CRC患者外周血ctDNA中KRAS突变规律与临床病理特征的相关性，以及与肿瘤组织中KRAS突变的一致性。进一步了解CRC伴肝转移患者ctDNA基因表达情况及其临床意义。 研究方法： 1. 用基于qPCR的super-ARMS方法对95例AJCC分期为I-IV期的CRC患者ctDNA进行检测，评价组织突变、外周血ctDNA突变与临床病理特征之间的相关性，并通过评价组织中与ctDNA中KARS基因突变的一致性，来探索ctDNA在CRC患者中的应用价值。 2. 通过基于二代测序的方法，对20例结直肠癌伴肝转移的患者的组织标本，术前术后的ctDNA进行检测和分析，探讨组织和ctDNA基因突变的表达情况和相关的临床意义。 研究结果： 1. 组织KRAS基因突变与临床特征如年龄、性别、肿瘤家族史、是否吸烟、部位、血清CEA、TNM分期等因素无明显相关性。 2. 血浆ctDNA的KRAS基因突变和M分期相关（p<0.05），说明有远处转移患者突变率更高。 3. ctDNA与组织的KRAS一致性检验提示两者的总体kappa=0.34；进一步亚组分析中可以看到，年龄<60岁组、有肿瘤家族史、有淋巴结转移和远处转移、神经侵犯、脉管浸润、中高分化人群中kappa更高（0.4≤Kappa≤0.75）。M分期（OR=4.113，95%CI：1.289-13.127）为影响ctDNA与组织KRAS突变一致性的独立预测指标。 4. 通过 ctDNA检测KRAS突变的敏感度为33.33%，特异度为98.11%，阳性预测值93.33%，阴性预测值65%。 5. 组织DNA测序结果中突变率较多基因位点是TP53（15/20，70%），其次是KRAS（11/20，55%），APC（10/20，50%），PIK3CA（4/20，20%）。术前ctDNA突变率较多基因位点是TP53（13/20，65%），其次是KRAS（10/20，50%），APC（10/20，50%），PIK3CA（3/20，15%），ERBB2（2/20，10%）。术后血仅4例检测到不同程度的基因突变。 6. 术前ctDNA与组织检测基因突变结果高度符合，一致性（完全匹配和部分匹配）达85%。对于突变频率最高的TP53、APC、KRAS和PIK3CA基因，86.7%、90.9%、100%和75%的病例为组织、术前血均突变阳性。 7. 术后外周血cfDNA总量明显高于术前总量，cfDNA总量前后变化具有统计学意义（p<0.001）。对外周血ctDNA含量分析发现，术前外周血ctDNA含量明显高于术后含量，ctDNA含量前后变化具有统计学意义（p<0.001）。术前外周血突变阳性和阴性组中cfDNA总量、ctDNA含量无明显差异（p=0.053，p=0.48）。术后外周血突变阳性组中ctDNA含量明显比阴性组高（p=0.015）。 8. 对16例有效随访病例（随访时间>6个月）进行分析发现，术前和术后ctDNA突变状态与患者影像学复发无明显相关性。进一步比较cfDNA和ctDNA含量提示，术后复发与无复发患者其含量在术前、术后检测均无统计学差异。 研究结论： 1. 在CRC患者中应用super-ARMS法检测ctDNA是简便、可行的。ctDNA检测突变具有相对较高的特异度和阳性预测值。在年龄<60岁组，分期相对较晚的亚群中，原发肿瘤组织和ctDNA中KRAS基因突变的一致性尚可接受。对于晚期CRC患者，在选择抗EGFR靶向药物治疗前， ctDNA的检测可用于对KRAS基因突变情况进行初筛，避免不必要的治疗。 2. 基于二代测序的ctDNA的分子检测与组织基因检测突变的一致性较高，在检测治疗反应和耐药性方面，具有替代肿瘤组织基因检测的潜在效用。特别是对于无法取活检的肿瘤患者（如转移性癌症患者），或者当组织学样本的质量太差无法用于分子检测时。 3. 术前、后ctDNA突变状态和ctDNA、cfDNA含量与患者影像学复发无统计学相关性。但术前血、组织与术后血突变状态一致性可能与术后是否出现肿瘤复发的风险有关，其识别复发敏感性可能早于肿瘤指标的动态演变。 关键词： 结直肠癌，循环肿瘤DNA，循环游离DNA，二代测序 |
