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| 贪铜菌CNP-8分解代谢氯代硝基酚的研究
摘 要
卤代硝基芳烃是一类典型的环境异生物质，广泛应用于生产药物、染料、农药和杀虫剂。这类化合物大多具有致畸、致癌和致突变的性质，对生态环境和人类健康造成了严重的危害。氯代硝基酚是最常见的卤代硝基芳烃污染物，研究微生物对这类污染物的代谢途径和分子机制，不仅有助于我们了解这类污染物的环境命运，而且对应用微生物技术进行环境修复具有重要的意义。贪铜菌CNP-8是本实验室前期以2-氯-5-硝基酚（2-chloro-5-nitrophenol，2C5NP）为唯一碳源筛选到的一株细菌。最近，我们发现该菌株还可以分解代谢2,6-二氯-4-硝基酚（2,6-dichloro-4-nitrophenol，2,6-DCNP）和2-氯-4-硝基酚（2-chloro-4-nitrophenol，2C4NP）。于是，本研究开展了菌株CNP-8降解2,6-DCNP和2C4NP的代谢途径和分子机制研究，并利用该菌株实现了氯代硝基酚复合污染水体和土壤的微生物修复研究。
本研究证实了菌株CNP-8能够利用2,6-DCNP为唯一碳源和氮源生长。我们对该菌株降解2,6-DCNP的动力学进行了研究。生物转化结果显示，参与代谢的基因是诱导型的，于是结合基因组、转录组和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析，鉴定到菌株CNP-8中参与2,6-DCNP代谢的hnp基因簇。将参与代谢的关键酶HnpA、HnpB和HnpC在大肠杆菌中异源表达，利用亲和层析纯化，并进行了酶学分析和产物鉴定。结果显示，双组分单加氧酶HnpAB先催化2,6-DCNP氧化脱硝基生成2,6-二氯对苯二醌（2,6-dichloro-1,4-benzoquinone，2,6-DCBQ），被还原成2,6-二氯对苯二酚（2,6-dichlorohydroquinone，2,6-DCHQ），随后进一步催化2,6-DCHQ脱氯，并生成6-氯偏苯三酚（6-chloro-1,2,4-benzenetriol，6-CBT）。HnpC催化6-CBT开环生成2-氯-马来酰乙酸（2-chloro-maleylacetate，2CMA）。基因敲除和互补实验证实hnpA基因是CNP-8菌株降解2,6-DCNP所必需的基因。本研究首次揭示了菌株CNP-8降解2,6-DCNP的代谢途径和分子机制。
本研究前期发现菌株CNP-8还能降解2C4NP，初步鉴定该菌株通过偏苯三酚途径降解2C4NP。目前，关于微生物降解2C4NP的代谢途径相关报道表明革兰氏阳性菌是通过偏苯三酚途径降解2C4NP，革兰氏阴性菌则是通过2-氯对苯二酚途径降解2C4NP。菌株CNP-8作为一株革兰氏阴性菌，其分解代谢2C4NP的途径却有别于以往报道的革兰氏阴性菌，和革兰氏阳性菌具有相同的代谢途径。于是，我们进一步从分子和生化水平揭示了该菌株降解2C4NP的代谢机制。RT-qPCR分析显示参与2,6-DCNP代谢的hnp基因簇可能也负责2C4NP的代谢。酶学分析显示，HnpAB能顺序催化2C4NP脱硝和脱氯，生成开环底物偏苯三酚（1,2,4-benzenetriol，BT），随后由HnpC催化开环生成马来酰乙酸（maleylacetate，MA）。基因敲除和互补实验表明hnpA基因也是菌株CNP-8降解2C4NP所必需的基因。对HnpA的进化起源分析发现，虽然菌株CNP-8具有和其他革兰氏阳性2C4NP降解菌一样的代谢途径，但是HnpA与其他革兰氏阳性菌中的2C4NP单加氧酶具有不同的进化起源。本研究首次发现革兰氏阴性细菌可以通过偏苯三酚途径代谢2C4NP，增加了我们对微生物降解2C4NP代谢多样性的认知。
基于菌株CNP-8能降解2C4NP、2C5NP和2,6-DCNP等多种卤代硝基酚，而且其代谢途径和代谢机制已得到了清楚的阐释。我们进一步对菌株CNP-8在微生物修复领域的应用前景进行了研究。利用菌株CNP-8对同时加入三种氯代硝基酚的模拟污水和污染土壤分别进行了污染修复实验实验，结果表明菌株CNP-8能快速降解环境污染中的三种氯代硝基酚，展现了菌株CNP-8在氯代硝基酚复合污染环境中的实际应用潜力。
关键词：Cupriavidus sp.CNP-8；代谢机制；2,6-二氯-4-硝基酚；2-氯-4-硝基酚；生物修复
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