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| 甲羟戊酸途径合成番茄红素的系统优化 第1章 绪论 1.1 番茄红素及其合成路径 1.1.1 番茄红素 17世纪70年代，Hartsen从番茄中提取出来一种深红色的晶体，被证实是类胡萝卜素的一种，因为最先是在番茄中提取而来的，故称为番茄红素(lycopene)。在自然界中，番茄红素普遍以色素的形式存在。同时，它被视为天然的食品添加剂，被许多个国家使用。近年来，番茄红素自身的抗癌、增强免疫力、抗氧化等功能，使其在医疗、食物保健、化妆品等领域都有广泛的应用，具有非常广阔的发展前景。这阶段获得番茄红素主要有三种，化学合成法，生物合成物和天然提取法。天然提取法是应用最普遍的获取番茄红素的方法，该种方法直接从番茄中提取番茄红素，但是该种方法的弊端是生产成本低，供应不能满足需求，而且产量也比较低；其次是化学合成法，通常以β-紫罗酮为生产原料，该种方法无法避免中间产物的有机试剂的滞留；现在最有发展前途的合成方法是微生物合成法，该种方法产量高，可以进行大规模的生产，造成的污染小，成本比较低。 番茄红素的生物合成和相关路径的调控一直是代谢领域的热门话题。目前，三孢布拉霉菌和大肠杆菌等常见的宿主细胞的番茄红素生物合成途径已被非常清楚地阐明。MEP途径合成番茄红素则是1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)催化甘油醛3-磷酸和丙酮酸缩合，然后在1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原酶（DXR）的催化作用下被转化为2-甲基-D-赤藓糖醇，最后产生IPP。随后，在crtE，crtB和crtI催化作用下，IPP转化为番茄红素。 根据番茄红素的重要前体物异戊烯基焦磷酸酯（IPP）的不同来源，番茄红素的合成分为两种路径：一种是2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径；另一种是甲羟戊酸（MVA）途径。 来自MVA途径的番茄红素的合成从乙酰-CoA开始，然后通过一系列催化反应形成甲羟戊酸，然后通过两步激酶反应产生甲羟戊酸焦磷酸，最后脱羧为IPP。（图1.1）通过MEP途径合成番茄红素在1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）催化作用下，甘油醛3-磷酸和丙酮酸发生缩合，然后是1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原酶（DXR）的催化下生成2-甲基-D-赤藓糖醇，最终生成IPP。随后，在crtE，crtB和crtI催化作用下，IPP转化为番茄红素。 图 1.1 MVA和MEP途径 Figure 1.1 MVA and MEP pathway 1.1.2 MVA途径 在MVA途径中，首先将乙酰-CoA缩合成β-羟基-β-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）。 该反应涉及到的酶是乙酰-CoA硫解酶（AACT）和HMG-CoA合成酶（HMGS）。HMG-CoA还原酶（HMGR）催化HMG-CoA形成甲羟戊酸（MVA），然后MVA经历焦磷酸化和脱羧两步反应形成异戊二烯焦磷酸（IPP）。HMGR被认为是甲羟戊酸途径中的第一个限速酶，它的抑制剂普伐他汀和相关化合物的特异性抑制剂被广泛用作降胆固醇药物。 现阶段，类异戊二烯类化合物主要从植物中提取，生产成本较高。然而，MVA途径的成功优化使得通过基因工程合成萜类化合物成为了可能。Martin V. et al 利用大肠杆菌作为宿主细胞，过量表达酿酒酵母中的MVA途径的关键酶和紫穗槐-4,11二烯合酶，成功合成了紫穗槐蒽醌，它是高效的抗疟疾药物—青蒿素的前体物。Pitera DJ等利用MVA途径合成类异戊二烯化合物时发现，当中间体HMG-CoA在大肠杆菌细胞中积累时，细胞生长受到很大地抑制作用，所以通过调节HMG-CoA还原酶的表达水平，消除MVA代谢途径的限制性瓶颈，从而增加中间代谢产物甲羟戊酸（MVA）的产生。AntíaRodrígue-Villalón采用两种不同的策略来增加番茄红素的产量：(1) 通过将DXS酶置于弱启动子调控下的MEP途径中，不添加诱导剂IPTG，番茄红素的产量是对照组的8倍；(2) MVA下游途径在大肠杆菌中过度表达，在添加中间体MVA的条件下，番茄红素的产量比对照细菌增加了12倍，最终浓度达到228mg /L，这充分表明了MVA途径的合成效率远远高于MEP途径。安东尼等通过遗传密码子优化，调节启动子强度和质粒拷贝数，从MVA途径中优化了两种关键酶—甲羟戊酸激酶 (MK) 和紫穗槐二烯合酶 (ADS)。与对照菌株相比，产量提高7倍，达到了至293mg/L。 Yoon SH. et al 优化外源MVA途径以增加β-胡萝卜素产量，并优化来自不同来源的MVA上游和下游途径，最终选择来自肺炎链球菌的MVA上游途径和来自粪肠球菌的MVA下游途径来构建完整的MVA途径，最后，通过与β-胡萝卜素合成相关的基因在细胞中共表达，最终工程菌获得465 mg/mL的β-胡萝卜素。Kim在大肠杆菌细胞中共表达外源MVA途径和β-胡萝卜素合成相关基因，优化了发酵条件和发酵模式，最终的结果表明，β-胡萝卜素的最适发酵温度为37℃。在底物是甘油的情况下，β-胡萝卜素的最大产量是663mg/L，合成速率为24.6 mg/L×h。Newman在大肠杆菌细胞中构建了含有9个关键基因的紫穗槐二烯生物合成途径。由于紫穗槐二烯的挥发性，通过发酵分离和尾气偶联的手段，提取紫穗槐二烯，并通过最终的浓缩，得到了0.5 g/L的紫穗槐二烯。 Ro D.K.使用酿酒酵母作为宿主，通过表达MVA途径和紫穗槐二烯合成酶和单加氧酶，成功实现大麦素的生物合成。 1.2 异戊二烯焦磷酸异构酶 异戊二烯焦磷酸异构酶（Isopentenyl diphosphateDelta isomerase，EC 5.3.3.2），是番茄红素等萜类化合物合成途径中的关键酶，位于MVA途径的末端，催化IPP和DMAPP相互转化。IPP和DMAPP是萜类化合物的前体物。它们通过不同比例的结合，形成各种长度的萜类化合物。IDI催化的质子化和去质子化的反应相较普通的质子转移反应的不同点是形成异构化的碳碳双键，这种反应类型非常少见。所以IDI的相关结构和这种特殊的催化原理的研究对于我们深入了解萜类化合物的合成具有重要意义。同时，异戊二烯焦磷酸异构酶在药物方面也有很大的潜能，可以通过它的相关抑制剂的研究，调控目标生物的代谢作用。 1.2.1 异戊二烯焦磷酸异构酶IDI的来源及分类 常见的异戊二烯焦磷酸异构酶有两种类型：I型异戊二烯焦磷酸异构酶（IDI1）和II型类异戊二烯焦磷酸异构酶（IDI2）。它们的活性类似，氨基酸序列却大不相同。IDll需要二价阳离子（Mg2+或Mn2+）作为其辅助因子。在植物中，idi1基因作为一个基因家族存在，例如，在拟南芥，橡胶树和烟草中有两个idi1基因存在，而在水稻和万寿菊中只有一个idi1基因。在植物中，IDI在细胞质和叶绿体比较常见。在古细菌和一些细菌中发现了IDI2的存在。IDI2需要依赖于FMN和NAD(P)H，属于羟酸脱氢酶家族，它的催化机制尚不清楚。所以以下讨论仅限于I型异戊二烯焦磷酸异构酶IDI1。 1.2.2 异戊二烯焦磷酸异构酶IDI的催化机理的探究 IDI涉及到的碳碳双键的反应非常罕见，几乎没有在其它生物中发现。所以在不清楚IDI自身的结构的情况下，许多科学家耗费了极大的精力尝试探索它的催化机理。这些实验包括质子交换和IPP和DMAPP类似物的探究。这些实验表明，首先，IPP和DMAPP之间的转化是一种选择性的立体结构的氢转移的异构反应（图1.2），其次，这种质子化和去质子化的过程具有很高的选择性，其中可能伴有碳正离子中间体的形成。一个可能的假设是，IDI的活性位点构成了活性口袋，底物烯丙基侧位于活性空腔内部，而它的两侧存在着两个活性位点，这两个残基负责质子化和去质子化两个关键的步骤。 1.2.3 异戊二烯焦磷酸异构酶IDI的结构生物学研究 自2001年以来，对异戊二烯焦磷酸异构酶的研究取得了重大突破，来自大肠杆菌的IPP异构酶的结构和不同的底物和IPP异构酶结合的晶体结构被解析出来，加深了人们对异戊二烯焦磷酸异构酶的结构和反应机理，也验证了之前一系列探索异戊二烯焦磷酸异构酶反应机理的实验的正确性。。 大肠杆菌IPP异构酶含有182个氨基酸，通过折叠形成了球形结构，在该结构内，α-螺旋包裹着β-折叠（图1.3）。未经EDTA处理的异戊二烯焦磷酸异构酶包含有多个α螺旋和β折叠，而焦磷酸异构酶的N-末端的序列在EDTA的作用下，将产生额外的β-折叠，一个全新的结合位点因此产生。 图 1.3 来自于大肠杆菌的IPP异构酶的整体结构 Figure 1.3 Overall fold with secondary structure of E. coli IPP isomerase. 1.2.3.1 大肠杆菌异戊二烯异构酶活性口袋的组成 根据蛋白和几种底物类似物的结合的结构分析，与IPP异构酶相关的金属离子和周围的氨基酸形成作用力，进而形成了一个活性空腔。组成活性空腔的氨基酸位点主要包括Cys67，Tyr104，Glu116 和Trp161。（图1.4）。 图 1.4 底物NIPP与大肠杆菌IPP异构酶结合活性位点示意图 Figure 1.4 View of the binding site of wild-type IPP isomerase in complex with NIPP IPP异构酶必须的二价金属离子与金属离子附近的氨基酸（包括His25，His32和His69咪唑环的各一个N原子和Glu116羧基的氧原子以及Glu114羧基的氧原子）构成的扭曲八面体结构构成了上述的螯合位点。（图1.3）底物NIPP的周围，分布着没有参与活性空腔的构建的Glu116和Cys67，说明当底物和酶结合时，这两个位点也处于在底物碳碳双键的周围，又没有参与到活性空腔的构建，那么这两个位点非常有可能参与质子的传递。不同的金属离子同不同的氨基酸结合，不同的金属离子的相关的化学物理生物性质都不一样，与活性空腔结合后，影响它的形状进而影响到底物附近的两个关键酶的活动空间，进而影响到催化效率，这也是为什么焦磷酸异构酶与不同的金属离子组合的活性不同。此外，活性空腔结合不同的金属离子的扭曲方式也非常独特，并且在其他蛋白质中从未发现。 在大肠杆菌异戊二烯焦磷酸异构酶的结构中，位于活性空腔的深处的Trp 161可能也是一个重要的活性位点。活性空腔的底部是Trp 161的吲哚环（图1.3）。Trp161不仅仅参与了活性空腔的构建，更重要的是它的吲哚环同碳正离子中间体形成阳离子-π作用，增加了碳正离子的稳定性，使转移质子的过程更容易发生。Trp161和碳正离子中间体形成的阳离子-π作用的证据是大肠杆菌焦磷酸异构酶的晶体结构和底物类似物NIPP结合的晶体结构（图1.3）。NIPP是IPP和DMAPP碳正离子中间体的模拟物。在NIPP和焦磷酸异构酶的结合的晶体结构中，带正电荷的N原子与Trp161吲哚环之间存在相互作用，说明了在实际反应中，该吲哚环将与碳正离子中间体正相关联，形成阳离子-π相互作用。该位点的突变W161F几乎完全丧失酶活，这主要是因为阳离子-π的相互作用需要极化作用，而苯丙氨酸自身具有非常弱的极化能力，并且难以参与阳离子-π。 1.2.3.2 底物与大肠杆菌异戊二烯焦磷酸异构酶的结合 通过分析大肠杆菌异戊二烯焦磷酸异构酶和底物结合的结构中，科学家发现大部分底物与酶的结合的重点是焦磷酸基团和酶的活性空腔的结合，主要差异在于底物的烃基部分。 IPP异构酶的相关残基和NIPP的去质子化的氮原子相互作用，维持了NIPP的烃基的稳定。所以，Glu116和cys67位于底物NIPP的带正电荷的基团附近，形成了一个四面体的构象，而NIPP的甲基基团在相互作用力的影响下延伸至Cys67（图1.3）。带正电荷的N原子与Glu116的非共轭羧基氧直接形成离子作用，同时与Trp161的吲哚环发生阳离子-π相互作用。 通过NIPP和周围的残基的相互作用，维持了NIPP的焦磷酸根基团的稳定。在这个相互作用力交织的网络中，还存在第二个金属结合位点。如果我们将前面提到的螯合位点称为催化结合位点，则该位点可以被称为底物结合位点。该位点主要是六配位的螯合位点，由二价离子和氧原子以及NIPP的焦磷酸根基团的几个水分子和IPP异构酶的相关残基组成。和该位点相互作用的相关原子有残基Cys 67和Glu87的羧基氧原子，底物NIPP的焦磷酸基团的非桥连氧原子和额外的两个水分子。 Wouters等详细分析了底物NIPP和各种金属二价离子的结合作用。首先，通过PDB数据库，对各种金属离子结合的焦磷酸异构酶进行搜索，发现它们的共性，这种依赖于二价金属离子的结合方式普遍存在与底物和酶的结合体系中。然后仔细分析了202种含有Mg2+和O3POPO3(CH2)2基团的蛋白质，发现Mg和O之间的距离和角度的分布规律，距离平均值为2.0 Å，分布范围为1.6 Å至2.4 Å。NIPP的焦磷酸基团和Mg2+的结合符合这一统计规律。 1.2.4 异戊二烯焦磷酸异构酶IDI的应用及研究现状 MVA途径的很多相关酶都是经典的药物靶点。例如，降胆固醇药他汀类是HMG- CoA还原酶的抑制剂，以及异戊二烯焦磷酸异构酶，本身就是一类重要的药物靶点。例如，降胆固醇药物他汀类是HMG-CoA还原酶的抑制剂，而异戊二烯焦磷酸异构酶本身就是一类重要的药物靶点。 一些目前已知的焦磷酸盐化合物，如环氧化的，溴化的和氟化的类异戊二烯焦磷酸盐，是γδT细胞抗原。这些化合物可以通过非常稳定的共价结合作用于焦磷酸异构酶结合在一起，阻止它和其它物质作用，是异戊二烯焦磷酸异构酶的常见的抑制剂，抑制作用不可逆。 虽然，焦磷酸异构酶的结构得到了解析，催化机理得到了一定的探究，但是，这些发现仍然不能很好地解释一些问题，例如焦磷酸异构酶催化的质子转移的反应的起始质子的来源和不同情况下的异构反应的可逆性。不同来源的焦磷酸异构酶的基因序列差异很大，该部分是否对酶的功能有影响尚不清楚。 同时，异戊二烯焦磷酸异构酶处于甲羟戊酸途径的尾部，并催化IPP转化成DMAPP。它是萜类化合物合成的关键酶。另外，由于单萜，倍半萜和二萜以及其他萜类需要不同比例的IPP和DMAPP，为此，可以通过调节IPP和DMAPP的比例来调节它们的最终流量。因此，研究异戊二烯焦磷酸异构酶在萜类化合物合成中的表达特性具有重要意义。 1.3 甲羟戊酸激酶 甲羟戊酸激酶（Mevalonate kinase，EC 2.7.1.36），是MVA途径的限速酶之一，在催化过程中，需要ATP的参与。在MVA转化成MVAP的过程中，ATP的一个磷酸基团被转移至MVA，形成MVAP。 1.3.1 甲羟戊酸激酶MK的来源及分类 1.3.1.1 微生物甲羟戊酸激酶基因 现阶段，来自不同微生物的甲羟戊酸激酶已经被发现（图1.5）。经过基因测序和比对，我们发现，不同来源的微生物甲羟戊酸激酶的基因序列差异不同，但是它们都有3个保守区间，这3个保守区间很可能和催化过程有直接的关系，但不同来源的酶的保守区域存在细微差异，主要体现在残基官能团增加或减少，碳链的长度变化;，电荷性质的变化，这些可能导致酶的活性位点附近的空间结构及其与底物的亲和力的细微变化。 1.3.1.2 动物甲羟戊酸激酶基因 来自于人体和动物体内的甲羟戊酸激酶基因也被分离和研究。氨基酸序列比对结果与微生物的氨基酸序列比对结果相同，这些酶也有三个保守区间，表明它们的催化机制类似，并且在不同物种之间的保守区域的氨基酸序列也存在微妙的差异（图1.7）。通过对比可知，保守区域3在物种之间维持着相对稳定。这些残基官能团的变化将影响酶和底物之间亲和力，这也间接地影响了酶促的反应速度。 1.3.1.3 植物甲羟戊酸激酶基因 从不同的植物中分离出各种来源的甲羟戊酸激酶基因。来自拟南芥的甲羟戊酸激酶基因是第一个从植物中分离和克隆的甲羟戊酸激酶基因。不同植物来源的甲羟戊酸激酶的氨基酸序列同样具有三个保守区域（图1.7）。在保守区1和2，不同的甲羟戊酸激酶的保守性不同，而在保守区3，所有的植物氨基酸序列保持稳定。 1.3.2 甲羟戊酸激酶MK的结构生物学特性 从1958年起，科学家已经从多种生物中分离克隆了大量不同来源的甲羟戊酸激酶。它们的动力学参数和酶活性质随着不同的来源而变化。在冷冻的情况下，鼠肝甲羟戊酸激酶将不可逆地失去活性，在pH小于6的情况下，鼠肝甲羟戊酸激酶永久性失活；来自猪肝的甲羟戊酸激酶对酸性环境耐受性很低，pH小于5.1时，便永久性失活。萜类化合物对甲羟戊酸激酶的抑制作用十分明显。番茄红素的中间体如焦磷酸香叶酯（GPP）和焦磷酸法呢酯（FPP）是最常见的反馈抑制剂，这些萜类化合物的存在对甲羟戊酸激酶的活性有很大的影响。对来自动物和植物的甲羟戊酸激酶的研究表明，不同长度的萜类化合物对该酶的抑制作用十分显著。 1.3.2.1 甲羟戊酸在酶中的结合位点 甲羟戊酸激酶在催化过程中，不仅仅要和底物MVA结合，还需要ATP和Mg的参与，这个过程是持续性进行的，而不是同时进行。与甲羟戊酸激酶结合的第一个底物是甲羟戊酸，然后将Mg和ATP与酶连接。随后，首先释放5-磷戊酸，然后释放ADP。鼠甲羟戊酸激酶的晶体结构（图1.8）显示一个很大的空隙存在于两个结构域之间，这个空隙与ATP的γ-磷酸结合位点相邻。不同来源的甲羟戊酸激酶拥有类似的保守空间，所以，两个结构域之间的空隙被类似的氨基酸包围。在这个间隙内，ATP的γ-磷酸酯和甲羟戊酸的C5羟基距离很近，而Arg 241，Thr 243和Ala 334形成了一个活性空腔，MVA的羧基在这个活性空腔的内部。带正电荷的Arg 241与MVA的羧基形成盐桥，增强了底物与酶的结合力；Ala 334处保守区域3，它所在的环含有较多的甘氨酸，处在该环的酰胺氮与底物的羧基之间形成氢键；Gly 142位于保守区域2中，并且MVA的C3的羟基与保守区域2所在的环的羰基形成氢键；His 20位于保守区域1，位于活性空腔的顶部，是活性空腔入口的组成部分；Glu 19和Lys 330形成盐桥，从而稳定了结构域之间的界面。当甲羟戊酸激酶与MVA结合时，活性空腔的构型将发生变化。构成活性空腔的残基将调整方向，保守区域2,3所在的环会发生移动，促使底物和酶的结合更加稳定。当酶和底物MVA，ATP，Mg结合，形成三级复合物时，由于活性空腔的变化，活性位点和MVA，ATP结合更加紧密，MVA还可能和额外的残基继续形成作用力。因此，保守区1和保守区3可能变得更接近。 1.3.2.1 ATP在酶中的结合位点 ATP和MgCl2与酶结合的晶体结构表明，ATP和Mg的电子密度是在两个区域之间的裂缝中产生的。在与ATP分子结合的酶的构象中（图1.9），ATP的相关集团的氧原子与Asn55，Ser135的相关氢原子形成氢键，而其中ATP的另外一部分结合Ser108和Asn104。镁离子和ATP的磷酸根基团结合的位点被保守区域2所在的环（140GAGLGSSAA148）包围，并且与Glu 193的羧基和Ser 146的羟基配位，而Glu 193和Ser 146通过氢键彼此连接。通过氢键和盐桥稳定地结合ATP的焦磷酸基团影响了甲羟戊酸激酶的性质，Lys 13与Asp 204形成盐桥，影响甲羟戊酸激酶的pKa。 1.3.3 甲羟戊酸激酶MK的应用及研究现状 为了深入探究甲羟戊酸激酶在MVA途径乃至生物的代谢中所起的作用，Lluch等人使用拟南芥甲羟戊酸激酶cDNA探针与各种位点的RNA进行Northern杂交。结果表明，在所有组织中都检测到存在甲羟戊酸激酶的基因片段，在根和花序中具有最高的表达水平，而且，甲羟戊酸激酶的活性受光照的影响很大。通过将甲羟戊酸激酶基因的5'端及其前导序列与前5个密码子组合，构建MVK：GUS嵌合体基因表达载体并转化入拟南芥并可用于幼苗的所有组织。这种表达载体被发现。在不同的部位，GUS活性不同，生长分裂越旺盛的部位，GUS的活性越高，这说明，细胞正常的新陈代谢需要甲羟戊酸激酶的参与。 Champenoy和Tourte通过CaMV35S启动子的作用将酵母甲羟戊酸激酶基因（ERG12）转化成烟草。发现酵母甲羟戊酸激酶的过量表达使植物中甲羟戊酸激酶的活性平均提高了60％，这也加速了植物再生过程并引起了独特的开花现象。 Champenoy等人构建酵母甲羟戊酸激酶基因及其启动子的ERG12-GUS融合基因并转化烟草。发现融合基因首先在快速分裂的根和侧根中表达，淀粉在幼叶的积累十分可观，酶活也较之前有很大的提升。。这表明甲羟戊酸激酶参与细胞生长所必需的大量物质的合成，例如叶绿素，细胞分裂素和异戊二烯基蛋白，其在细胞周期调控中起重要作用。 在微生物研究领域，甲羟戊酸激酶的研究重点在于相关抑制剂的研发，酶的抑制作用，从而探索有效新药的开发，开放解决植物和动物以及微生物相关疾病的新道路。在动物体内，甲羟戊酸激酶参与到胆固醇的合成，但是，胆固醇并不是一类有利于健康的物质。对于比较容易合成胆固醇的食用型动物，我们可以通过各种安全健康的抑制剂来调控动物中的胆固醇的合成，也可以使用基因工程的手段，通过基因改造，调控甲羟戊酸激酶的表达水平，降低胆固醇生产。 |
