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| 一株海绵共附生真菌次生代谢产物的研究 中文摘要 目的：对一株海绵共附生真菌次生代谢产物进行研究，分离纯化获得一系列化合物，并对其进行结构鉴定。方法：采用溶剂提取法提取样品,采用薄层色谱、硅胶柱色谱等对一株海绵共附生真菌次生代谢产物进行分离纯化，通过其理化性质分析和核磁共振氢谱、核磁共振碳谱对纯化的化合物进行结构鉴定。结果：从一株海绵共附生真菌中分离得到3个化合物，经鉴结构分别是邻苯二甲酸二正丁基酯；19Z,31Z-二烯-1-五十酸；3β-羟基-谷甾醇-5-烯。结论：上述3种化合物都是从该真菌次生代谢产物中分离纯化得到的。此三种化合物都是已知化合物。关键词：共附生真菌；海绵；次生代谢产物；结构鉴定 STUDY ON SECONDARY METABOLITES FROM A SPONG-SYMBIOTIC FUNGI ABSTRACT Objective:The secondary metabolites from a sponge-symbiotic fungi were studied. A series of compounds were isolated and purified from the secondary metabolites. And their structures were identified. Methods: The sample was extracted by using solvent extraction method. The secondary metabolites from a sponge-symbiotic fungi was Purified by gel column chromatography, TLC preparation techniques, silica gel column chromatography. Their structures were established by spectral analyses and 1H-NMR,13C-NMR. Results: Three compounds were separated from a sponge-symbiotic Fungi and were identified . They are (19Z,31Z)-pentaconta-19,31-dienoicacid,dibutylphthalate,(3S,9S,10S,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-ethyl-6-methylheptan-2-yl)-9,10,13-trimethyl-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol.Conclusions: These compounds were separated and purified from a sponge-symbiotic fungi, All three are known compounds. Key Words: symbiotic fungi; sponge; secondary metabolite; structural identification 正文海绵（Sponge）是一类最原始的多细胞物种，归属于多孔动物门（Porifera）。起源可追溯到寒武纪，其中大约有390个属源自白垩纪(1.35－0.65亿年前)。海绵共约有5000个种，可以把其分为790属80科。 海绵生活地域呈世界性分布：从淡水到海水，从浅水到深海。由此可见,海绵的历史悠久、种类丰富、分布广泛。海绵虽然由于没有器官分化造成构造简单、物理防御缺乏，但其在生存竞争面对其他物种时，分泌了许多的具有攻击性和毒害性的次生代谢产物，由此获得生存。这些次生代谢产物成为寻找药物先导化合物的基础。近年来,国内外都对海绵的代谢产物作了研讨。从结果中发现 ,有活性的代谢产物实际上绝大多数可由其共附生的微生物（如真菌）产生的, 并从海绵共附生微生物（如真菌）中发现很多与其宿主相同、类似或相关的活性独特、结构新颖的次级代谢产物,其结构主要包含物碱类、环肽类、大环内酯类、生甾类等[1-3]。早先发现的海绵共附生真菌的活性次级代谢产物具有不饱和程度、高易成环等特点。其生物学活性包含了抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗疟原虫、细胞毒活性、激酶抑制活性、降解污染物等。为了寻找有药用前景的海洋天然产物,本实验对一株海绵共附生真菌次生代谢产物进行了研究。 1材料与方法1.1材料1.1.1样品 海绵共附生真菌样品是由中国南海海洋所提供。工作人员采集海南省三亚市梅山岛海域水深10～20米的海绵，然后从中分离出一株真菌。该菌株尚未鉴定出具体的菌种。样品分离出的一株真菌经培养得到的次生代谢产物。 1.1.2仪器 ZF-2型三用紫外仪(上海市安亭电子仪器厂)；BT224S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；OSB-2100旋转蒸发仪EYELA(上海爱郎仪器有限公司)；电子调温万用电炉（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；DLSB-5120低温冷却液循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；薄层色谱展开缸(上海信谊仪器厂有限公司);玻璃点样毛细管(上海申立玻璃仪器销售有限公司);铁架台(冀州市辉華儀表厂);硅胶柱、凝胶柱等玻璃仪器（北京欣维尔玻璃仪器有限公司）。 1.1.3试剂 柱色谱硅胶200～300目及300～400目（青岛海洋化工厂分厂产品）；薄层层析硅胶厚制备板(烟台江友硅胶开发有限公司);薄层层析硅胶板(5cm×10cm)(烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂和烟台江友硅胶开发有限公司)。95%乙醇A.R(桂林弘昊实验设备有限公司);三氯甲烷、无水甲醇均为A.R（西陇化工股份有限公司）；二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、60－90℃石油醚均为A.R(西陇科学股份有限公式)；显色剂为自配的5%硫酸乙醇溶液。 1.2实验方法 1.2.1海绵共附生真菌次生代谢产物的提取 冷提法：将海绵共附生真菌发酵物用95%乙醇溶液浸泡3次，过滤提取液，合并滤液，滤液用OSB-2100旋转蒸发仪EYELA减压冷凝回收溶剂并得浓缩液，合并浓缩液，再浓缩得浸膏，干燥。 1.2.2 海绵共附生真菌次生代谢产物的分离纯化 薄层色谱的使用： （1）硅胶柱洗脱系统的选择:以石油醚和丙酮;石油醚和乙酸乙酯;二氯甲烷和丙酮;二氯甲烷和甲醇系统为溶剂跑完板,以能使样品最高点距离为全板约五分之四的板比较，选择样品分离距离最大的系统为洗脱剂系统。使用这个系统不同比例的溶剂作为展开剂，选比移值为0.2的展开剂为该样品硅胶柱的洗脱剂。 （2）薄层色谱分离纯化样品的展开剂：选择需要的样品，以石油醚和丙酮系统;石油醚和乙酸乙酯系统;三氯甲烷和丙酮系统;三氯甲烷和甲醇系统这四个系统为展开剂跑完板，以样品在全板约上四分之三的板比较，所需样品分离最好的为薄层板(20cm×20cm)的展开剂。 将上述处理好的样品（称取约150g）用甲醇溶解,与硅胶（300-400目）（136g）以1.1:1进行拌样并干燥。根据样品量选择合适的硅胶柱，以适量石油醚为溶剂，与硅胶（300-400目）搅拌均匀，进行湿法上样。在硅胶柱层析时，以石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯系统(45:1→25:1→15:1→7:1→3:1→1:1→1:3) 作为流动相进行梯度洗脱，得到87小馏分(硅胶柱下每次接洗脱剂的体积为硅胶柱内硅胶体积的三分之一为一小馏分)，洗脱液经薄层分析，合并得到23个馏分。其中标记为y-31的合并馏分选取87个小馏分中第31-35号进行合并，将其标记后继续实验。 将y-31用适量的甲醇和丙酮溶解，与硅胶（300-400目）以1.1:1进行拌样并干燥。根据样品量选择合适的硅胶柱，以石油醚为溶剂，与硅胶（300-400目）搅拌均匀，进行湿法上样。在硅胶柱层析时，以石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯系统（13:1→9:1）梯度洗脱，经TLC检测：将y-31的第9～23、24～29、30～42、43～50、51～67、68～88个小馏分分别合并，分别记为y-31-9、y-31-24、y-31-30、y-31-43、y-31-51、y-31-68，其余在薄层硅胶板上不显示点或者质量少的小馏分舍去。 把y-31-9进行TLC检测，选取最合适的洗脱剂系统为二氯甲烷：丙酮(500:1)。将y-31-9继续用少量丙酮和甲醇溶解溶剂溶解，与硅胶（300-400目）以1.1:1进行拌样并干燥。根据样品质量选择合适的硅胶柱，以二氯甲烷为溶剂，与硅胶(300-400目)搅拌均匀，进行湿法上样。在硅胶柱层析时，经以二氯甲烷：丙酮(500:1)梯度洗脱，得可用的到73个小馏分。经TLC检测：将y-31-9的第11～17、18～24、25～32、33～39、40～52、53～64分别合并，分别记为y-31-9-11、y-31-9-18、y-31-9-25、y-31-9-33、y-31-9-40、y-31-9-53，其余在薄层硅胶板上不显示点或者质量少的小馏分舍去。将y-31-9-18以石油醚:乙酸乙酯(7:1) 为展开剂系统中进行薄层(薄层板的面积为20cm×20cm)层析，得到y-31-9-18-1、y-31-9-18-2。经石油醚和丙酮;石油醚和乙酸乙酯;三氯甲烷和丙酮;三氯甲烷和甲醇四个系统检测，化合物y-31-9-18-1为纯品，为化合物1。y-31-9-18-2因量少且不纯舍弃。 把y-31-30进行TLC检测，选取最合适的洗脱剂系统为石油醚:乙酸乙酯(12:1)。将y-31-30用适量丙酮和甲醇溶解溶剂溶解，与硅胶（300-400目）以1.1:1进行拌样干燥。根据样品质量选择合适的硅胶柱，以石油醚为溶剂，与硅胶（300-400目）搅拌均匀，进行湿法上样。在硅胶柱层析时，以石油醚:乙酸乙酯(12:1)梯度洗脱，得可用的到67个小馏分。经TLC检测：将y-31-31的第9～16、17～24、25～33、34～36、37～43、43～52、52～62分别合并，分别记为y-31-30-9、y-31-30-17、y-31-30-25、y-31-30-34、y-31-30-43、y-31-9-52，其余在薄层硅胶板上不显示点或者质量少的小馏分舍去。将y-31-30-9以展开剂氯仿:甲醇(180:1)进行薄层(薄层板的面积为20cm×20cm)层析，得到y-31-30-9-1、y-31-30-9-2、y-31-30-9-3。经石油醚和丙酮;石油醚和乙酸乙酯;三氯甲烷和丙酮;三氯甲烷和甲醇系统检测，化合物y-31-30-9-2为纯品，为化合物2。y-31-30-9-1因量少且不纯舍弃。将y-31-30-9-3以展开剂石油醚:丙酮(9:2)跑薄层板(薄层板的面积为20cm×20cm)，得到y-31-30-9-3-1，经石油醚和丙酮;石油醚和乙酸乙酯;三氯甲烷和丙酮;三氯甲烷和甲醇系统检测，化合物y-31-30-9-3-1为纯品，为化合物3。 将以上3个纯化产物送至广西研究测试中心进行核磁共振氢谱和核磁共振碳谱测定。以下为海绵共附生真菌化学成分分离的流程图 石油醚（60-90℃）:乙酸乙酯=45:1→25:1→15:1→8:1→3:1→1:1→1:2 二氯甲烷：丙酮(500:1) 石油醚:乙酸乙酯=12:1 石油醚:乙酸乙酯=7:1 氯仿:甲醇=180:1 石油醚:丙酮=9:2 图1海绵共附生真菌次生代谢产物分离流程图 Figure 1 Flowchart of the separation of the secondary metabolites from sponge-symbiotic fungi 2结果 通过薄层色谱、硅胶柱色谱等对海绵共附生真菌次生代谢产物的分离纯化，得到三个纯化产物，将以上3个纯化产物送至广西研究测试中心进行核磁共振氢谱和核磁共振碳谱测定，结果见附图。 2.1化学结构的鉴定结果 图2化合物1结构式 Figure 2 The structure of compound 1 图3化合物2结构式 Figure 3 The structure of compound 2 图4化合物3结构式 Figure 4 The structure of compound 3 化合物1:无色油,4.32g;分子式为C16H2204。通过附图1 给出1H-NMR ( 600 MHz, CDCl3) 谱，可得出δ( ppm):7.76(2H,m,H-3,6)、7.56(2H,m,H-4,5)、4.31(4H,m,H-1＇)、1.73(2H,m,H-2＇)、1.47(4H,m,H-3＇)、0.99(2H,m,2＇) 的质子信号。通过附图213C-NMR( 150 MHz，CDCl3 ) 谱，可得出δ167.79(COO-)，132.42(C-1,2)、131.04(C-4,5)、128.98(C-3，6)、65.71(C-1＇)、30.68(C-2＇)、19.31(C-3＇)、13.86(C-4＇) 碳信号。根据上述 NMR 数据，并参照文献[4]鉴定化合物 1为dibutyl phthalate。 化合物2:无色油状物，5.72g; 分子式为C50H96O2。通过附图3 1H-NMR ( 600 MHz, CDCl3) 谱，可得出δ( ppm):5.36 (4H,s,H-19,20,31,32)、2.33(2H,m,H-2)、1.55(2H,m)、2.02(8H,m)、1.42～1.29 (76H,m)、0.86(3H,m,H-50)的质子信号。通过附图413C-NMR( 150 MHz，CDCl3 ) 谱，可得出δ179.65(C-1)、130.15(C-19,20)、129.92(C-31,32)、34.08(C-2)、32.05(C-3)、29.89(CH2)、29.83(CH2)、29.76(CH2)、29.72(CH2)、29.57(CH2)、29.50(CH2)、29.46(CH2)、29.36(CH2)、29.26(CH2)、29.18(CH2)、29.15(CH2)、27.36(CH2)、24.84(CH2)、22.85(CH2)、14.31(C-50) 碳信号。根据上述NMR 数据，并参照文献[5]鉴定化合物 2为(19Z,31Z)-pentaconta-19,31-dienoic acid。 化合物3：白色无定型粉末，自配的5%硫酸乙醇溶液中显示紫红色，3.34g;分子式为C31H54O。通过附图5 1H-NMR ( 600 MHz, CDCl3) 谱，可得出δ( ppm): 5.36(3H,m,H-6)、3.5402(1H,m,H-3)、0.99(3H,m,19-CH3)、0.80～0.98(12H,m,4XCH3)、0.6817(3H,m,18-CH3)的质子信号。通过附图613C-NMR( 150 MHz，CDCl3 ) 谱，可得出δ140.87（C-5）、121.84(C-6)、72.96(C-3)、56.87(C-14)、56.17(C-17)、50.16(C-9)、45.95(C-13)、42.43(C-4，23)、39.79(C-12)、37.37（C-1）、36.27(C-10)、35.12(C-20)、34.05(C-21)、32.01(C-7)、31.99(C-8)、31.78(C-2)、29.15(C-16)、28.36(C-24)、26.17(C-22)、24.33(C-15)、23.08(C-28)、21.10(C-11)、19.95(C-25)、19.53(C-27)、19.05(C-26)、18.89(C-29) 、12.11(C-19)、11.98(C-18)的碳信号。根据上述 NMR 数据，并参照文献[6]鉴定化合物3为(3S,9S,10S,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-ethyl-6-methylheptan-2-yl)-9,10,13-trimethyl-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol。 3 讨论 本文利用硅胶柱层析、薄层制备等分离方法对一株海绵共附生真菌的化学成分进行研究，从海绵共附生真菌中共分离纯化得到3个化合物。 化合物1(邻苯二甲酸二正丁基酯)是一种邻苯二甲酸酯类化合物。邻苯二甲酸酯类化合物可以作为塑料的增塑剂、去泡剂、驱虫剂、农药的载体、香昧品、化妆品和润滑剂的生产原料[7]。因为其难降解、分布使用广泛并且可以通过生物链浓缩的特性，现其已被公认为全球性的环境有机污染物，特别是对水环境的污染，已引起世界各国的重视。现如今越来越多的人在研究其降解方法。生物降解是减少环境中邻苯二甲酸酯类化合物的主要途径。有研究员发现海绵共附生真菌有降解污染物的作用[8]。那么，海绵共附生真菌是否能降解邻苯二甲酸酯类化合物值得进一步研究。 化合物3(3β-羟基-谷甾醇-5-烯)能表现出非常广泛的药理活性，主要的活性有：抗癌症 、抗菌、抗氧化、抗炎、镇 痛、免疫调节 、抗动脉硬化抗、高血脂 、抗溃疡 、抑制血小板聚集等[9]。具有基本无毒特性的 3β-羟基-谷甾醇-5-烯具有较好的应用前景，可对医学、食品科学、生命科学具有较高的参考价值，希望能够得到更加广泛的临床研究与应用。 在本次试验过程中，有一段期间在最后纯化过程中分离的样品总是不纯，甚至在薄层板上拖尾严重。分析得到两个原因：其一，实验条件的选择判断上缺乏经验，不会选择合适的溶剂系统。其二，刚刚开始接触实验，对实验操作不熟练，造成有些分离步骤不到位。 本次实验只用到正相硅胶过柱子，若采用跟更多的分析纯化方法，分离效果会更好。冷静心态、明睿的思想、从容的操作过程、正确的操作方法和态度对实验过程也非常重要。 参考文献 [1]Shigemori H, Bae M A ,Alteramide A . A new tetracyclic alkaloid from a bacterium Alteromonas sp.associated with the marine sponge Halichondria okadai [ J] .J Org Chem.1992, 57:4317-4320. [2]Kobayashi J, Ishibashi M .Bioactive metabolites of symbiotic marine microorganisms [ J] .Chem Rev .1993, 93:1753-1769. [3]Unson M D, Holland M D, Faulkner D J.A brominated secondary metabolite synthesized by the cyanobacterial symbiont of a marine sponge and accumulation of the crystalline metabolite in the sponge tis-sue [ J] .M ar Biol, 1994, 199:1-11. [4]李莉娅,李军,付宏征,等.中国南海海绵Cinachyrella australiensis化学成分研究[J].北京大学学报(医学版),2004(01):12-17. [5]Giacomo Berretta , Geoffrey D. Coxon . Synthesis of cis,cis-diunsaturated a-meromycolic acid by a palladium-catalysed alkyl–alkyl Negishi reaction [ J]. Tetrahedron Letters, 2012,53:214–216. [6]刘涛,王宇,华会明，等.海洋来源真菌Hypocrea virens的次级代谢产物研究[J]沈阳药科大学学报,2012,29(02):93-97. [7]胡晓宇,张克荣,吴德生,等.中国环境中邻苯二甲酸酯类化合物污染的研究[J].中国卫生检验杂志,2003(01):9-14. [8]宋恺,胡洁,林文翰,等.海绵共附生真菌多样性及其次级代谢产物的研究进展[J].生物技术通报,2014(04):36-42. [9]肖志彬,贾韩学,刘小雷. β-谷甾醇药理活性的研究现状[J]. 世界最新医学信息文摘,2015,(08):66-68. 综述 海绵共附生真菌活性代谢产物的研究进展 中文摘要 目的：综述海绵共附生真菌活性代谢产物的研究进展。 方法： 查阅文献, 进行归纳和整理。结果与结论：从海绵共附生真菌中已分离得到许多结构独特, 活性多样的代谢产物,寻找出具有潜在的药用价值的活性代谢产物。 关键词：海绵；海绵共附生真菌；活性代谢产物 1 海绵共附生真菌 海绵是一门多孔滤食性异养动物，起源可追溯到寒武纪，其中有390属已被公认源自白垩纪(1.35-0.65亿年前)。海绵栖息地广泛，从浅海到深海都可观察到海绵，由于生活的条件变化多端，环境也不相同(如水流大小不一)，致使附着在其表面的基质类型也不相同，因此形成了繁多的海绵种类。海绵没有明确的组织，更不用说器官，但其因为有细胞的分化，所以细胞的种类非常繁杂，海绵动物大多生存在海水运动的海底，营固着生活。海绵通过海水携带氧气、微小藻类、细菌和其它可分解碎屑，经环状物的过滤，再转变过程摄取养料。这种奇特的滤食、摄食系统，使海绵体内体表聚集了丰富的微生物(如真菌), 这些微生物(如真菌)能够与海绵相互作用，产生多种结构新颖、生物活性独特的化合物。1950 年 ，Bergmann 等首次从海绵中分离得到尿嘧啶阿拉伯糖苷，并得出尿嘧啶阿拉伯糖苷是抗癌先导化合物。从此对海绵的研究从此多了起来，越来越多海绵共附生真菌活性代谢产物被发现使得对人们海绵共附生真菌的研究其成为重要的海洋药物资源。本文就海绵共附生真菌活性代谢产物的研究进展进行综述。 2 海绵共附生真菌的活性代谢产物 2.1 抗肿瘤(细胞毒活性) 肿瘤是机体在各种致癌因素作用的条件下，局部组织的某一个或某些细胞发生基因突变，且在基因水平上失去对其增殖分化的正常调控和人体自身免疫不能清除，而导致克隆性异常增生、对周围细胞进行侵入形成的病变。近几年来,肿瘤的发病人数和死亡人数在持续升高[1],所以寻找新的作用途径、疗效高、不良反应少的抗肿瘤药迫在眉睫。 1997年，日本科学家第一次报道了：海绵共附生真菌产生的 3 种活性化合物对 P388 淋巴癌细胞具有显著的细胞毒活性，越来越多的海绵共附生真菌产生的活性化合物被发现具有抗肿瘤活性。2011年赵琨等从一株海绵共附生真菌Pleosporaceae sp.中分离出2种中甾体类化合物1和2，对其进行了细胞毒活性测试，两者对肺癌细胞A549和白血病细胞HL60有着较弱的肿瘤细胞增殖抑制活性，10 μM时的抑制率小于50％[2] 。 张晓敏从西沙海绵来源的具黄曲霉HDNl4-107(Aspergillus aureolatus)的次级代谢产物提取出化合物3，对此化合物进行体外抗肿瘤活性测试，结果表明化合物3对人的肿瘤细胞具有普遍的细胞毒活性，用SRB法测定对Hela细胞的IC50值为27.45pM，用MTT法测定IC50值，测得其对K562、HL.60细胞的IC50分别为40.21pM和32.33 pM[3]。 图1化合物1~5结构式 Figure 1 The structures of compounds 1 ~5 Peter 实验组从地中海海绵 Axinella verrucosa 中分离获得一株真菌 Penicillium sp.，从该菌种的代谢产物中分离出 2 个新的衍生物communesins C(4)和D(5) ，经 MTT 法测试，显示这2 个化合物对 6 种白血病细胞有细胞毒活性, 其中化合物4对 MOLT-3、化合物5对 SUP-B15 的 ED50 值分别为 8.6、9.0 μg·mL-1[4]。 2.2 抗菌 抗菌药的不合理和大量使用、微生物以适应环境而加速变异，使得微生物的耐药性和抗药性逐渐变强, 微生物对抗菌药的耐药性和抗药性一直是成功治疗人类细菌性疾病的重大障碍 ,所以药物学家一直在寻找高效、不良反应少的新的抗菌药物。其中有经过化学方法对现有抗菌药进行结构修饰和改造，研发出一些生物活性更强、不良反应降低的药物，但是其活性作用靶点和官能药效团基本没有改变，也有可能会出现交叉耐药性。如果从天然产物中发现、筛选和开发结构新颖、活性作用靶点和官能药效团不同的有抗菌活性的先导化合物,就有可能解决抗菌药有耐药性的问题。科研人员也不断从海绵共附生真菌代谢产物中提取分离纯化到有抗菌活性化合物。 Edrada R A课题组从印度尼西亚采得海绵 Xestospongia exigua ，从中分离出一株真菌 Penicillium cf .montanense,从该菌产生的代谢产物分离纯化出3个具有新的抑菌活性的化合物，为 xestodecalactonesA-C(6～8),这三个化合物在浓度为 100,50,20 μmol/L 时对白色念珠菌的抑菌圈分别为 25,12 ,7 mm[5]。2001 年，Jadulco 课题组从印度尼西亚的采得的海绵 Callyspongia aerizusa，从中分离获得一株真菌 Cladosporium herbarum，经过过活性导向办法进行分离纯化，获得有抗菌活性化合物sumiki’s acid (9)及其衍生物acetyl sumiki’s acid (10)，经琼脂扩散实验结果表示在5 g时能对S. aureusB. 和sub tilis 有较弱的活性(抑菌圈直径为7 mm)[6]。 图 2 化合物6 ~10的结构式 Figure 2 The structures of compounds 6 ~10 2010 年，Pruksakorn等从海绵来源真菌Trichoderma sp.中分离纯化获到 3 个新颖的氨基脂肽类化合物，为Trichoderins A、A1、B(11～13) ,对其进行抗菌活性测定，发现化合物11～13对缺氧休眠状态和正常生长条件下的分枝杆菌都有明显的抑制活性，其MIC的测定范围在 0.02～2.0 μg/mL 之间[7]。 图 3 化合物11 ~13的结构式 Figure 3 The structures of compounds 11 ~13 2.3 激酶抑制 激酶抑制是抑制蛋白激酶活性的化合物, 蛋白激酶是催化蛋白质磷酸化过程中的一类活性官能团不相同的酶，此过程主要在基因表达的翻译过程，因此在调节基因表达中起着关键的作用。由此可见,研究天然产物中有激酶抑制活性的化合物也非常重要。 Peter 等在地中海海绵 Aplysina aerophoba 中分离出一株真菌 ,从该菌代谢产物中分离纯化出7个新化合物，其中有4个化合物(14 ～ 17)是EGF、PKC和CDK4受体酪氨酸激酶的抑制剂[8] 图4化合物14 ~17的结构式 Figure 4 The structures of compounds 14 ~17 2.4降解污染物 海绵共附生真菌具有特异性与选择性，使得其在特定的海洋环境中发挥着至关重要的生态学作用。这使得从海洋共附生真菌中更容易发现具有化学防御及抑制污损生物附着等生态功能的天然活性化合物。 2012 年，王长云等从海绵 Xestospongia testudinaria 分离出一株曲霉属 Aspergillus sp.，从该真菌中分离得到两个具有抗污损活性的没药烷型倍半萜 (18 和 19)，活性测试表明这两个化合物在 25.0 mg/mL 浓度下能明显抑制藤壶幼虫的附着[9]。 图 5 化合物18 ~19的结构式 Figure 5 The structures of compounds 18 ~19 2.5抗疟原虫 疟原虫是寄生性的单细胞原生动物物种。这些疟原虫在人体内的无性增殖和在蚊虫体内的有性繁殖，蚊虫携带疟原虫的通过这些繁殖，再经叮咬人方式传播和扩散，引起疟疾寒热反复发作。疟原虫的主要致病原因是在血液红细胞的内期裂体增殖期过程入侵。致病力强弱与人体自身免疫系统的状态、侵入的虫的种类和数量有关。同时，疟疾容易再燃和复发成为治疗疟疾的一大难点。在屠呦呦等发现了青蒿素具有抗疟疾之前，人们没有效果好的药物用于彻底治疗疟疾。药学家也从海绵共附生真菌中也寻找到抗疟原虫活性代谢产物。 Almeda 等在海绵 Callyspongia sp. cf. C. flammea中分离到一种真菌Stachylidium sp. ，从其代谢产物中分离纯化获得4个化合物marilones A-C，silvaticol。其中 marilonesA(20)可以对伯氏疟原虫Plasmodiumberghei有抑制作用，其IC50 值为 12.1 μmol/L，Marilone B（21）对于 5-HT2B的有拮抗作用[10]。 图 6 化合物20 ~21的结构式 Figure 6 The structures of compounds 20 ~21 2.6 环氧合酶抑制 环氧合酶(cyclooxygenase,简称 COX)是一种酶(又称酵素), 是合成生物激素(如前列腺素家族)最主要的酶，前列腺素家族过多部位会导致炎症和疼痛。环氧合酶抑制剂大多数为解热镇痛抗炎药。其抗炎作用机制是通过抑制环氧合酶从而达到减少前列腺素的合成。 2015年, 贺卫军课题组从一株海绵共生真菌ZSDS1-F11次生代谢产物中分离出化合物22和23,对氧合酶-1具有较弱的抑制活性, IC 50 分别为 27.2 和 2.93μmol/L, 这些化合物还需要在结构修饰和改造等方面作进一步的探究,以期发现潜在的药用价值[11]。 图7化合物22 ~23的结构式 Figure7The structures of compounds 22 ~23 2.7抗病毒 海绵通过环状物的过滤流经体内的水流并转化吸收食物的摄食方式使得其时刻要面临海水中病原菌的侵入，所以海面共附生真菌代谢产物中应也有抗病毒类的化合物。 Ma X 等从西沙群岛中分离出海绵 Xestospongia testudinaris来源的葡萄穗霉菌Stachybotrys chartarum MXH-X73，从这个真菌的代谢产物中分离纯化出Stachybotrins D～F(24～26)、stachybosides E和F（27和28）、stachybosidesA和B（29和30），31可通过靶向逆转录酶抑制HIV-1病毒：抑制rtRNA依赖的DNA聚合酶的EC50为50μmol/L, 对NNRTIS抗性病毒(HIV-1RT-K103N.V108I、HIV-1RT-K103N、HIV-1RT-L100I.K103N、HIV-1RT-K103N.P225H和HIV-1RT-K103N.G190A)以及野生型 HIV-1(HIV-1wt)的EC50分别为13.3、7.0、23.8、14.2、8.4和6.2μmol/L[12] 。 图 8 化合物24 ~31的结构式 Figure 8 The structures of compounds 24 ~31 张晓敏从西沙海绵来源的具黄曲霉HDNl4-107(Aspergillus aureolatus)的次级代谢产物提取出化合物表明化合物32、33工作度为5μM时抑制率分别为60．6％、52．5％，具有与实验阳性药(47．4％)相当或略强的抗H1N1流感病毒活性[3]。 3.结语 科学家针对海绵共附生真菌已开展了许多研究工作, 发现了许多有生物活性的代谢产物，人们逐渐认识到: 海绵共附生真菌具有多样性, 海绵共附生真菌代谢产物中有着许多结构新颖、生物活性强的抗肿瘤、抗菌等化合物,而且已经成为开发研制新药物的宝贵资源。 随着现代科学技术的不断发展, 通过综合运用多种学科的方法与技术, 将会为海绵共附生真菌的深入研发提供思路和技术，使得能够跟容易和快速发现更多有生物活性的海绵共附生真菌代谢产物。 参考文献 [1]Wanqing Chen, Hongmei Zeng, Jie He, et al. Annual report on status ofcancer in China, 2011[J].Chinese Journal of Cancer Research,2015,27(01):2-12. [2]赵琨,陈敏,王长云,等.一株海绵共附生真菌Pleosporaceae sp.中甾体类化合物及其生物活性[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2011,41(12):81-85. [3]张晓敏. 一株海绵来源真菌活性次级代谢产物的研究[D].中国海洋大学,2015. [4]Jadulco R, Edrada R A, Ebel R, et al. New Communesin deriva-tives from the fungus Penicillium sp.derived from the Mediter-ranean sponge Axinella verrucosa [ J] .J Nat Prod, 2004, 67:78-81. [5]Edrada R A, Heubes M , Brauers G , et al. Online analysis of xestodecalactones A-C, novel bioactive metabolites from the fungus Penicillium cf.montanense and their subsequent isolation from the sponge Xestospongia exigua [ J] .J Nat Prod, 2002, 65:1598-1604 致 谢 在此特别感谢桂林医学院，为我提供了良好的实习环境，使我的实习得以圆满地结束。感谢在这期间给予我帮助的领导、老师和同学，是他们无私的帮助使我不仅顺利地完成实习任务，还学到了很多课外知识。 我特别感谢我的指导教师李云秋老师，本课题是在他的悉心指导和帮助下圆满完成的，从最初的选题、定题、实验到最后论文的撰写与修改都倾注了老师无限的心血和汗水！在实验过程中特别感谢李云秋老师在实验思路与方法上给我的指导，教会我如何发现问题、分析问题和解决问题，他指导我们完成实验及论文的书写，给予我们很多建议。他认真严谨的工作态度对我的影响深远，让我明白明白了要想成功就要拥有的冷静心态、明睿的思想、从容的面对困难。 此外还要真挚地感谢辛甜师姐、苏莉莉同学在实验中给予我的帮助，教会我很多实验技能，大家齐心协力才顺利的完成了本课题的研究。 华丽的词藻都无法表达我对你们深深的谢意，再次感谢老师们在生活中给予我的关怀与建议。 祝老师们工作顺利，身体健康，培养出更多更优秀的学生！ |
