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| 实时荧光定量PCR法与尿液流式细胞仪UF-1000i尿液细菌计数的比较研究 摘要 目的: 1.建立快速检测尿液细菌计数及革兰氏染色阳性球菌和革兰氏染色阴性杆菌DNA的最佳提取方法。 2.应用实时荧光定量PCR（FQ-PCR）法与尿液流式细胞仪UF-1000i两种方法对尿液细菌计数的基础性能进行比较研究，为临床快速诊断和治疗尿路感染提供可靠依据。 方法： 1.用紫外-可见分光光度法和麦氏比浊对标准菌株ATCC27853（铜绿假单胞菌）和ATCC29212（粪肠球菌）进行细菌计数，比较两种方法的相关性以及吸光度和细菌浓度的关系。 2.采用煮沸法、碱液煮沸裂解法，氯仿提取法对标准菌株ATCC27853（铜绿假单胞菌）和ATCC29212（粪肠球菌）进行细菌DNA提取，并应用FQ-PCR法进行扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳比较分析。 3.用标准菌株ATCC27853（铜绿假单胞菌）和ATCC29212（粪肠球菌）制成不同浓度菌悬液（活菌和死菌），应用FQ-PCR法和细菌培养两种方法对尿流式细胞仪UF-1000i尿液细菌计数进行性能评价。 结果： 1.在麦氏浊度0.4-0.8范围内，铜绿假单胞菌和粪肠球菌吸光度（625nm波长处）和麦氏浊度有良好的线性关系。铜绿假单胞菌、粪肠球菌浓度为108CFU时，在波长为625nm处的吸光度值分别为0.163和0.155，麦氏浊度二者都为0.5。 2.三种方法对铜绿假单胞菌DNA的提取效果相同；对粪肠球菌，煮沸法经PCR扩增未见对应的扩增产物，氯仿提取法和碱液煮沸裂解法提取DNA的效果相同。 3.UF-1000i对两种菌检测的线性范围均在103-107CFU/ml，铜绿假单胞菌重复精密度CV在12.72%-19.46%之间，培养法为25.1%；粪肠球菌重复精密度CV在14.49%-15.57%之间，培养法为23.0%。UF-1000i和培养法对细菌计数测定无显著差异（p＞0.05）；FQ-PCR法对两种菌检测的线性范围均在105-1011CFU/ml之间，铜绿假单胞菌和粪肠球菌的重复精密度CV分别在11.38%-19.76%之间、12.86-23.28之间。FQ-PCR法和培养法对细菌计数测定无显著差异（p＞0.05）。对死菌的检测，UF-1000i法检测铜绿假单胞菌和粪肠球菌的准确性分别为78.9%和94.7%；FQ-PCR法检测铜绿假单胞菌和粪肠球菌的准确性分别为81.5%和98.4%。培养法对两种菌检测的准确性为0%（不能培养出死菌）。 结论：
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