| 以下仅列出文章摘要、提纲简介，如需获取全文阅读权限，或原创定制、长期合作，请随时联系。 微信QQ:312050216 |
 |
 |
| 七叶树内生菌及七叶皂苷微生物转化研究 摘 要 七叶树又名娑罗树，其干燥种子为具有重要药用价值的传统中药材“娑罗子”，有效成分主要为七叶皂苷，具有抗肿瘤、消炎、抗渗出等功效。现在报道的热点集中在药理作用和临床运用，关于内生植物和代谢物的相关报道很少。 陕西省汉中地区是娑罗果的重要产区，由于近年来野生七叶树资源过度开发利用，加之生态破坏严重,使得七叶树的野生资源越来越匮乏。陕西省汉中市是七叶树的主要种植区，每年产大量娑罗子销往全国各地。钻研汉中区域七叶树内生菌对七叶树种质资本的开发利用有积极意义。同时对梭罗果有效成分的积累也具有指导意义。 本试验从七叶树根、茎中筛选获得出内生细菌48株，分属为4个属，分析内生细菌抑菌活性，试验结果证实20株细菌具备差异性水平的抑菌活性。结合紫外-可见光，HPLC分析，筛选具有代谢产七叶皂苷能力的细菌菌株WJ51。对菌株WJ-51发酵。对发酵液处理后对其提取物进行抑菌活性检测、抗肿瘤活性检测； 本研究从七叶树根、茎中分离得到内生真菌44株，分属20个属，研究抑菌活性，结果显示44株真菌具有不同程度的抑菌活性。结合紫外-可见光，HPLC分析，筛选具有代谢产七叶皂苷能力的真菌菌株GM43、GM66、GM88。发酵后检测其抑菌活性及抗肿瘤活性，证明发酵液提取物能抑制A549细胞的增殖。 本研究从七叶树内生菌中筛选得到一株具有转化七叶皂苷能力的菌株，经分子生物学及心态学分析鉴定为黄曲霉，经柱层析分离七叶皂苷及其转化产物，经TLC、HPLC、UPLC-MS定性定量分析七叶皂苷及其转化产物。初步推断A2为细叶远志皂苷，确定七叶皂苷的转化产物有21β-巴豆酰基原七叶皂苷元（A1），21β-当归酰基原七叶皂苷元(A3)。 关键词：七叶树；内生细菌；内生真菌；转化 目 录 第1章 引言 1 1.1 研究背景 1 1.1.1 七叶树概况及其药理作用 1 1.1.2 药用植物内生菌分离研究现状 2 1.1.3 皂苷类物质提取方法研究进展 4 1.1.4 微生物转化皂苷类物质研究现状 5 1.2 研究目的及意义 8 1.3 研究内容 8 1.4 技术路线 9 第2章 七叶树内生细菌多样性及生物活性研究 13 2.1 试验材料及仪器设备 13 2.1.1 试验材料 13 2.1.2 供试病原菌 13 2.1.3 培养基及相关试剂 13 2.1.4 主要仪器和设备 13 2.2 实验方法 14 2.2.1 内生细菌的分离与鉴定 14 2.2.2 内生细菌基因组DNA提取 14 2.2.3 菌株的16S rDNA基因扩增 14 2.2.4 菌株的16S rDNA基因分子鉴定 15 2.2.5 内生细菌生物活性研究 15 2.2.6 产七叶皂苷内生细菌筛选 15 2.2.6.1 显色反应的筛选 15 2.2.6.2 菌株菌落及细胞形态鉴定 15 2.2.6.3 筛选细菌的系统分类地位 15 2.2.6.4 液态发酵、代谢产物的提取 16 2.2.6.5 提取物成分可见－紫外光全波长扫描分析 16 2.2.6.6 提取物成分HPLC分析 16 2.2.6.7 提取物成分的抑菌活性分析 16 2.2.6.8 提取物成分的抗肿瘤活性分析 16 2.3 结果与分析 16 2.3.1 内生细菌分离鉴定结果 17 2.3.2 菌株的16SrDNA的扩增与测序及系统发育树分析 17 2.3.3 内生细菌生物活性研究 17 2.3.4 产七叶皂苷细菌菌株的筛选 18 2.3.4.1 显色反应的筛选 18 2.3.4.2 菌落形态鉴定 19 2.3.4.3 菌株系统学分类地位 19 2.3.4.4 全波长扫描结果 19 2.3.4.5 提取物成分HPLC分析 20 2.3.4.6 提取物成分的抑菌活性分析 21 2.3.4.7 提取物成分的细胞毒性分析 22 2.4 小结与讨论 22 第3章 七叶树内生真菌多样性及生物活性研究 24 3.1 试验材料及仪器设备 24 3.1.1 试验材料 24 3.1.2 供试病原菌 24 3.1.3 培养基及相关试剂 24 3.1.4 主要仪器和设备 25 3.2 实验方法 25 3.2.1 内生真菌的分离与鉴定 25 3.2.2 内生真菌基因组DNA提取 26 3.2.3 七叶树内生真菌系统发育分析 26 3.2.4 内生真菌生物活性研究 26 3.2.5 产七叶皂苷内生真菌筛选 27 3.2.5.1 显色反应的筛选 27 3.2.5.2 菌株菌落及细胞形态鉴定 27 3.2.5.3 筛选细菌的系统分类地位 27 3.2.5.4 液态发酵、代谢产物的提取 27 3.2.5.5 提取物成分可见－紫外光全波长扫描分析 27 3.2.5.6 提取物成分HPLC分析 28 3.2.5.7 提取物成分的抑菌活性分析 28 3.2.5.8 提取物成分的抗肿瘤活性分析 28 3.3 结果与分析 28 3.3.1 内生真菌的分离 28 3.3.2 内生真菌的分子生物学鉴定 29 3.3.3 真菌ITS 系统发育分析 30 3.3.4 内生真菌生物活性研究 33 3.3.5 产七叶皂苷真菌菌株的筛选 34 3.3.5.1 显色反应的筛选 34 3.3.5.2 菌落形态鉴定 35 3.3.5.3 菌株系统学分类地位 35 3.3.5.4 全波长扫描结果 36 3.3.5.5 提取物成分HPLC分析 38 3.3.5.6 提取物成分的抑菌活性分析 40 3.3.5.7 提取物成分的细胞毒性分析 40 3.4 小结与讨论 41 第4章 七叶皂苷微生物转化 44 4.1 实验材料及仪器设备 44 4.1.1 实验材料 44 4.1.2 主要仪器和设备 44 4.2 实验方法 45 4.2.1 七叶皂苷转化菌株的筛选与鉴定 45 4.2.1.1 菌株初筛 45 4.2.1.2 菌株复筛 45 4.2.1.3 GM91菌株初步鉴定 45 4.2.2 GM91转化七叶皂苷 45 4.2.2.1 摇床发酵培养 45 4.2.2.2 七叶皂苷转化产物的提取与分离 45 4.2.3 七叶皂苷及其转化产物的检测条件 46 4.2.3.1 薄层层析法鉴别七叶皂苷及其转化产物 46 4.2.3.2 HPLC法鉴别七叶皂苷及其转化产物 46 4.2.3.3 UPLC-MS 鉴别七叶皂苷及其转化产物 46 4.3 结果与分析 47 4.3.1 七叶皂苷转化菌株的筛选 47 4.3.1.1 菌株初筛 47 4.3.1.2 菌株复筛 48 4.3.1.3 GM91菌株的初步鉴定 49 4.3.2 GM91菌株转化七叶皂苷 49 4.3.3 七叶皂苷转化产物的提取 50 4.3.3.1 七叶皂苷及其转化产物的提取 50 4.3.3.2 七叶皂苷及其转化产物的分离纯化 51 4.3.4 样品的鉴定 52 4.3.4.1 HPLC测定 52 4.3.4.2 UPLC-MS检测 53 4.4 小结与讨论 54 结 论 57 参考文献 59 |
