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| DNA-PKcs蛋白免疫沉淀深度测序寻找结合RNA
摘 要
DNA-PKcs蛋白是DNA蛋白依赖激酶（DNAdependent Protein Kinase）的催化亚基，能够被两个亚单元Ku70和Ku80招募组成DNA-PK复合体，DNA-PK复合体非常重要，正因为有它的存在，人类DNA双链断裂(DSBs)的主要修复途径NEHJ(nonhomologous endjoining)才得以顺利进行[]。 研究表明蛋白质与RNA之间具有相互作用，在很多生命过程中两者互为因果，缺一不可，蛋白质是mRNA许多重要转化过程中的催化剂，比如m RNA的转录、剪接、出核、翻译以及降解等过程的顺利进行都需要蛋白质的调控，而且很多RNA想发挥功能就一定要通过与蛋白质的相互作用，成为结构性RNA，最终在复杂的生物学作用下形成复合体，功能才能发挥出来，如核糖体RNA就是最典型的例子[1-4]；此外，RNA与蛋白质组成的复合体如果结构或数量发生异常则有可能引起疾病，当中最主要的就是让人谈之色变的癌症。因此，从不同角度研究RNA、蛋白质以及进一步探索RNA与蛋白质的相互作用具有重要的意义。曾有文献表明，在所有的功能基因中，RNA-蛋白复合体所占比例已达23%[5]。因此，我们针对RNA-蛋白复合体角度研究DNA-PKcs蛋白在NEHJ修复途径中的作用，本实验在研究中使用了高通量测序技术对与DNA-PKcs蛋白结合的RNA进行深度测序，寻找能够与DNA-PKcs蛋白结合相互作用的RNA,进而研究特定RNA及其对应基因对细胞放射损伤反应的影响。 本研究首先构建DNA双链断裂细胞模型，利用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP）技术，选取特异性DNA-PKcs蛋白抗体针对细胞DNA-PKcs蛋白进行免疫沉淀，将沉淀复合物中蛋白与RNA分离提取,分别利用Western Blots与RNA凝胶电泳技术进行蛋白层面和RNA水平的初步验证。对于RIP实验捕获到的纯化RNA进一步进行高通量测序，将测序结果运用生物信息学方法进行分析，从数据结果中筛选出了富集程度较高，且一致性较好的ITGA3,ITGA5,ITGAV,SDC4,CD44基因作为后续研究的候选基因。之后使用qRT-PCR实验验证筛选出基因的表达，发现U2OS细胞经过8Gy照射后5个候选基因表达均有增高趋势，其中ITGA5和SDC4基因表达增高差异明显，作为目标基因。最后通过抑制目标基因ITGA5、SDC4与敲低DNA-PKcs蛋白的细胞系及对照细胞进行细胞粘附迁移实验，发现抑制ITGA5、SDC4基因表达能够抑制U2OS细胞粘附性和降低体外迁移率，效果与通过基因沉默或药物抑制DNA-PKcs蛋白表达具有一致性。这些结果提示我们ITGA5、SDC4基因可能与DNA-PKcs共同调节细胞细胞运动能力，为下一步研究提供线索。 目的 1. 利用特异性DNA-PKcs抗体针对DNA-PKcs蛋白进行RNA免疫沉淀，获取DNA-PKcs蛋白-RNA复合体； 2.将沉淀复合物中的蛋白与RNA分离提取,初步验证免疫沉淀特异性和RNA质量； 3.通过高通量测序分析所提取纯化后的RNA样品，生物信息学分析； 4.选择特定RNA及对应基因进行验证。 方法 常规培养人骨肉瘤细胞株U2OS，室温利用60Coγ射线，8Gy总剂量照射，沽源剂量率为85.69cGy/min，分别于照后0.5、1、2、4、8h和未照射(对照组)收取细胞，放-80 ℃保存，构建DNA双链断裂细胞模型。提取各个样品核蛋白，对其进行特异性RNA结合蛋白免疫沉淀，对沉淀复合物中蛋白和RNA分离提取,分离纯化RNA时利用DNA酶去除DNA干扰，Western Blots实验进行蛋白层面验证,利用RNA凝胶电泳实验和分光光度仪进行RNA水平初步验证。将备选RNA样品送至诺禾致源公司进行深度测序。针对RIP-seq数据，首先将测序获得的原始数据用Fast QC软件进行基本的质量统计NGStookit软件进行质控处理，然后用BWA（Burrows Wheeler Aligner）软件将过滤之后的reads比对到参考基因组上(Li, H. and R. Durbin, 2009)，接下来需要将比对结果进行拼接，这个过程主要通过 cufflink软件才能实现，除此之外对表达量的计算，也要通过cufflink软件才能完成。我们要选出一组基因，这组基因在表达的过程中与DNA-PKcs蛋白相互作用，我们要得到照射实验组（0.5h、1h）和对照组（con）的表达差异才能得到这组基因。然而，目的基因的功能信息的研究以及结果要通过对基因的进行注释（GO注释和KEGG 注释）才能得到。然后深入分析找出富集度较高，且一致性较好的基因，作为后续研究的候选基因。通过q-RT-PCR实验检测候选基因的表达，找出表达差异大的目标基因进一步研究其功能。使用siＲNA干扰技术抑制目标基因表达的细胞与DNA-PKcs敲低的siDNA-PKcs1、siDNA-PKcs2细胞及对照细胞siNC分别进行8Gy照射组和未照射组实验对U2OS细胞粘附能力和体外迁移的影响。 结果 1.实验所选DNA-PKcs 抗体能够特异性的免疫沉淀DNA-PKcs蛋白，且U2OS细胞照射后免疫沉淀沉淀获得DNA-PKcs蛋白表达随着时间的递增有递减趋势； 2.分光光度计测得分离纯化的RNA OD260/280范围符合1.8-2.2，RNA凝胶电泳有RNA显影； 3.选取空白对照（con）和照射后0.5h、1h样品送高通量测序。筛选出KEGG富集散点图及GO富集分析图中富集度高的3条代谢通路，富集通路基因交集有5个分别是ITGA3,ITGA5,ITGAV,SDC4,CD44； 4.qRT-PCR实验进行扩增检测筛选出来的5个基因，以β-actin为内参照，U2OS细胞8Gy照射后5个目标基因表达均有增高趋势，其中ITGA5和SDC4基因表达差异大于2倍； 5.使用siＲNA干扰技术抑制ITGA5、SDC4基因表达，细胞粘附性和迁移率明显降低，效果与DNA-PKcs蛋白表达抑制具有一致性。 结论 1.成功获得了与U2OS细胞DNA-PKcs蛋白复合体结合的RNA高通量测序库； 2.DNA-PKcs蛋白表达抑制可能会导致细胞粘附性和迁移率降低； 3.ITGA5、SDC4基因参与细胞粘附迁移功能。 关键词：DNA-PKcs蛋白 RIP 高通量测序 DNA双链断裂 |
