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| 3种巯基化合物延缓凡纳滨对虾黑变的效果与机制及其复合保鲜剂的研发 摘要 虾类捕获后在贮藏和加工过程中体表极易发生黑变，严重影响其感官品质和市场价值。虾类黑变主要是虾体内含有的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）在微生物作用下催化氧化反应的结果。传统用于延缓虾类黑变的添加剂主要是亚硫酸盐类和4-己基间苯二酚（4-Hexylresorcinol，4-HR）等，但是它们都存在一定的安全隐患。因此，开发绿色安全、高效、低成本的虾类黑变抑制剂是未来的发展趋势。 本研究以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为研究对象，根据预实验筛选出对凡纳滨对虾PPO具有较好抑制效果的3种巯基化合物（N-乙酰-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸、还原性谷胱甘肽），研究其抑制PPO的动力学和延缓对虾黑变和保鲜的效果，初步探讨3种巯基化合物与PPO的相互作用机制，并开发一种既具有延缓黑变又具有防腐效果的复合保鲜剂。本研究的主要内容和结果如下： （1）从凡纳滨对虾虾头中提取PPO，以4-HR和亚硫酸钠为对照，研究3种巯基化合物对PPO的抑制效果和动力学。结果表明：当L-半胱氨酸、N-乙酰-L-半胱氨酸和还原性谷胱甘肽的浓度分别为0.4、0.8、1.6 mg/mL时，与PPO 作用5 min，对PPO 的抑制率分别达85.3%、89.3%、91.2%；3 种巯基化合物在低浓度范围内（0～0.8 mg/mL）对PPO 的抑制表现为竞争性抑制，在较高浓度范围内（0.8～6.4 mg/mL）对PPO的抑制表现为不可逆抑制。因此，3 种巯基化合物对凡纳滨对虾PPO的抑制是两种机制并存的。 （2）以无菌水、亚硫酸钠和4-HR为对照，研究3种巯基化合物对冷藏条件下凡纳滨对虾的延缓黑变和保鲜效果。结果表明：与无菌水处理组相比，3种巯基化合物对凡纳滨对虾具有较好的延缓黑变效果，而且与亚硫酸钠的效果相当，但弱于4-HR的；3种巯基化合物对凡纳滨对虾不具有明显的保鲜效果。因此，3种巯基化合物可代替亚硫酸钠作为有效的虾类黑变抑制剂，但是如果要同时对虾进行保鲜，必须与其它抑菌物质复配。 （3）以从虾头中提取纯化的PPO为研究对象，利用光谱学（紫外光谱、圆二色谱、荧光光谱）技术分析3种巯基化合物与PPO的相互作用，初步探讨3种巯基化合物对PPO的抑制机制。紫外光谱和荧光光谱的结果表明：3种巯基化合物均与PPO发生了相互作用，主要是巯基化合物中-SH或-OH与PPO侧链的-NH2或C=O通过氢键和范德华力形成稳定的复合物，使PPO的疏水性降低，极性增加。圆二色谱的结果表明：3种巯基化合物均能使PPO 分子中ɑ-螺旋含量降低，β折叠含量增加。因此，3种巯基化合物主要是通过氢键和范德华力等作用改变了PPO的分子构象而抑制其活性。 （4）以虾类黑变评分为指标，采用响应面试验设计优化了一种延缓凡纳滨对虾黑变的复合保鲜剂配方，并应用于冷藏条件下的凡纳滨对虾。结果表明：复合保鲜剂的的配方为N-乙酰-L-半胱氨酸0.80 g/L、乳酸链球菌素（Nisin）0.10 g/L和乙二胺四乙酸（EDTA）0.20g/L。应用效果表明：复合保鲜剂不仅能有效延缓凡纳滨对虾黑变，而且具有较好的防腐保鲜效果；以菌落总数和TVB-N的一级鲜度为基准，复合保鲜剂比空白对照组和N-乙酰-L-半胱氨酸处理组均延长了6 d。复合保鲜剂经成本核算，每升保鲜液仅需0.06元。 综上所述，3种巯基化合物能够有效地延缓凡纳滨对虾的黑变，其中N-乙酰-L-半胱氨酸与乳酸链球菌素（Nisin）和乙二胺四乙酸（EDTA）复配后，对凡纳滨对虾不仅具有较好地延缓黑变的效果，而且具有较好地防腐保鲜的效果。同时复配后的保鲜剂比较廉价。研究结果为利用绿色、安全、廉价高效的延缓虾类黑变和防腐保鲜剂提供了理论基础和技术参考。 关键词：巯基化合物；多酚氧化酶；抑制机制；黑变；保鲜；凡纳滨对虾 目录 摘要 I Abstract III 1 绪论 1 1.1 凡纳滨对虾概述 1 1.2 虾类黑变现象与机理 1 1.3 化学法抑制虾类黑变的研究进展 3 1.3.1可逆性抑制 3 1.3.2不可逆抑制 7 1.4 复合防黑变保鲜剂研究进展 8 1.5 研究目的和意义 9 1.6 研究内容 9 2 3种巯基化合物对凡纳滨对虾PPO的抑制效果和动力学 11 2.1材料与方法 11 2.1.1材料 11 2.1.2试剂与仪器 11 2.1.3试验方法 12 2.2 结果与讨论 13 2.2.1反应时间对巯基化合物抑制PPO的影响 13 2.2.2 巯基化合物浓度对抑制PPO的影响 14 2.2.3 SDS-PAGE电泳分析和活性染色 16 2.2.4 三种巯基化合物的抑制PPO的动力学 17 2.3 本章小结 18 3 3种巯基化合物对凡纳滨对虾的防黑变和保鲜效果 19 3.1材料与方法 19 3.1.1材料 19 3.1.2试剂与仪器 19 3.1.3 试验方法 19 3.2 结果与分析 21 3.2.1 凡纳滨对虾在贮藏期间黑变评价的变化 21 3.2.2 凡纳滨对虾在贮藏期间感官评分的变化 23 3.2.3 凡纳滨对虾在贮藏期间菌落总数的变化 25 3.2.4 凡纳滨对虾在贮藏期间TVB-N的变化 26 3.2.4 凡纳滨对虾在贮藏期间pH值的变化 26 3.3 本章小结 27 4 3种巯基化合物对凡纳滨对虾PPO的抑制机制 28 4.1 材料与方法 28 4.1.1材料 28 4.1.2试剂与仪器 28 4.1.3试验方法 28 4.2 结果与分析 29 4.2.1 3种巯基化合物与PPO相互作用的紫外光谱分析 29 4.2.2 3种巯基化合物与PPO相互作用的荧光光谱分析 31 4.2.3 3种巯基化合物对PPO二级结构的影响 37 4.3 本章小结 39 5 一种延缓凡纳滨对虾黑变的复合保鲜剂配方优化和应用 40 5.1材料与方法 40 5.1.1材料 40 5.1.2试剂与仪器 40 5.1.3 试验方法 40 5.2 结果与分析 43 5.2.1 延缓黑变保鲜剂的配方优化 43 5.2.2 复合保鲜剂的延缓黑变和保鲜效果验证 45 5.3 本章小结 50 6 结论与展望 51 6.1 结论 51 6.2 展望 52 参考文献 53 |
