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| 弓形虫GRA28、GRA31基因敲除虫株的构建及其对鼠急性和慢性感染的影响 摘 要 弓形虫是一种机会致病性原虫，呈世界性分布，能够感染几乎所有的温血动物，引起严重的弓形虫病，对人类健康、畜牧业生产和公共食品安全造成危害。弓形虫的致密颗粒蛋白能参与宿主细胞内的转录，调节构成弓形虫速殖子纳虫泡膜和缓殖子囊壁的纳虫泡状结构及网状结构。弓形虫急性感染阶段，速殖子在纳虫泡中快速繁殖，引起机体的严重损伤，或在慢性感染阶段，缓殖子在囊膜中保持稳定状态，不被机体完全清除，造成持续感染。致密颗粒蛋白是虫体在宿主细胞内存活的关键蛋白，可以抵抗机体先天性免疫的攻击，保证了弓形虫在宿主细胞内快速生长发育或维持稳定状态，因而具有重要的研究价值。GRA28和GRA31是通过生物素化技术发现的新的致密颗粒蛋白，在弓形虫入侵宿主细胞，调节纳虫泡膜及网状结构，造成机体急性和慢性感染的影响还不明确，需要进一步的研究。同时，为研制新的抗弓形虫病的有效药物和疫苗提供思路。 本研究选取新发现的致密颗粒蛋白28和致密颗粒蛋白31，在弓形虫ME49虫株中，运用CRISPR/Cas9技术构建GRA28和GRA31基因缺失株，并研究基因缺失株对小鼠急性感染和大鼠慢性感染的影响，具体工作包括以下几个方面： (1) 弓形虫GRA28、GRA31基因缺失株的构建 首先，构建特异性的pSAG1-Cas9-TgU6-ccdB-sgGRA28/GRA31质粒和该基因相应的同源模板质粒pUC19-5’UTR-loxp-DHFR-loxp-3’UTR，然后将CRISPR质粒和同源模板片段按5:1的比例共转染到ME49速殖子中，培养一代后，加入乙胺嘧啶筛选，在96孔板中挑选单克隆，扩大培养后，对单克隆进行PCR鉴定，鉴定结果显示ME49△gra28、ME49△GRA31虫株构建成功。 (2) GRA28和GRA31基因缺失株对小鼠急性感染的影响 通过小鼠毒力实验比较基因缺失株和野生株的毒力差异，发现与野生株相比，GRA28基因缺失株毒力增强，而GRA31基因缺失株的毒力没有变化。通过对小鼠急性感染时期血清中细胞因子水平的检测，发现感染弓形虫的小鼠，在8d时都能产生高水平的IFN-γ，感染不同虫株的小鼠血清中产生IFN-γ的含量没有差异；感染ME49△GRA31虫株的小鼠在8d时，能调节Th2型免疫应答反应更快地产生高水平IL-6，有利于虫体的存活，而感染ME49△GRA28虫株的小鼠和野生株的小鼠，没有统计学差异；在11d时，感染弓形虫的小鼠产生IL-10，而感染不同虫株的小鼠产生IL-10的含量没有统计学差异。 (3)GRA28和GRA31基因缺失株对大鼠慢性感染的影响 基因缺失株和野生株成功感染F344大鼠后，通过持续体重记录发现，大鼠是否感染弓形虫，感染野生株或是基因缺失株，体重都没有明显变化。通过用PCR扩增529重复序列的方法来鉴定心、肝、肺和脑中包囊形成，发现所有大鼠的肝和肺组织中都没有形成包囊，感染GRA31基因缺失株的大鼠的心脏中形成少量包囊，而相同DNA含量作为模板条件下，感染GRA31基因敲除株的大鼠的脑组织扩增529重复序列条带更亮。取部分脑组织匀浆液进行DBA染色，在荧光显微镜下观察，感染GRA28基因缺失株和野生株的大鼠的脑组织样品中没有观察到脑包囊，而感染GRA31基因敲除株的大鼠，全脑可以形成几十到几百个包囊。对大鼠大脑皮层和海马进行HE染色，我们发现感染弓形虫的鼠的脑部病理变化都不明显，说明在正常免疫条件下，大鼠慢性感染阶段的脑组织炎症反应不强烈。 关键词：弓形虫，致密颗粒蛋白，CRISPR/Cas9，GRA28，GRA31  |
